核酸释放剂及其核酸释放方法技术

本发明专利技术涉及核酸释放剂及其核酸释放方法，该方案包括0.5

【技术实现步骤摘要】
核酸释放剂及其核酸释放方法


[0001]本专利技术涉及生物医药
，具体涉及核酸释放剂及其核酸释放方法。

技术介绍

[0002]PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应)是一种用于扩增特定的核酸片段的分子生物学技术，其最大特点是能将微量的核酸进行大量的富集和增加，从而达到便于检测微量核酸的目的。其中在医学诊断上常用的PCR方法主要是基于双荧光探针的实时荧光定量PCR(qPCR)方法，利用qPCR方法进行体外诊断的靶标主要包括人基因组DNA、DNA病毒、细菌、真菌和RNA病毒等。由于RNA的结构为单链结构，不稳定且容易降解，因此在样品的处理过程当中要求非常高，需要较为复杂的方法对待扩增的RNA样品进行前处理和核酸提取并纯化，得到纯净的核酸后，方能进行检测得到稳定的结果。
[0003]为此，目前应用于荧光定量PCR扩增的核酸提取方法主要有以下4种：
[0004](1)传统煮沸法：裂解液与血液样本混匀，高温裂解，离心得到核酸；
[0005](2)浓缩煮沸法：先用多聚糖浓缩沉淀病毒核酸，再加裂解液煮沸，离心得到核酸；
[0006](3)离心柱法：裂解后采用层析柱吸附核酸、再洗脱得到较纯的核酸；
[0007](4)磁珠法：用磁珠吸附核酸，再洗脱得到较纯的核酸。
[0008]上述前2种提取方法缺点是需要多次转管、移液、离心等步骤，样本处理耗时长，且在高温处理的操作中难免会丢失部分核酸，使最终用于PCR扩增的核酸样本的运量值偏低。而离心柱法虽然比上述两种煮沸法提取的核酸纯度会有大大提高，但手工操作的步骤多依旧存在效率低下的问题。磁珠法提取步骤简单，回收率高、纯度好，易于自动化，但产品价格昂贵，目前应用并不广泛。
[0009]因此，亟待一种回收效率高、操作简单及生产成本低的核酸释放剂及其核酸释放方法。

技术实现思路

[0010]本专利技术的目的是针对现有技术中存在的上述问题，提供了核酸释放剂及其核酸释放方法。
[0011]为了实现上述专利技术目的，本专利技术采用了以下技术方案：核酸释放剂包括0.5
‑
1.5M Tris
‑
HCl、30
‑
70mM EDTA、0.5
‑
1.5M半胱氨酸、10
‑
30U/μL RRI、DEPC水以及体积百分比浓度为15
‑
30％的NP
‑
40、体积百分比浓度为3
‑
7％的Poly A，其中RRI为RNA酶抑制剂。
[0012]工作原理及有益效果：1、与现有技术相比，本申请的核酸释放剂与传统的核酸释放剂成分完全不同，本申请将PolyA作为核酸助沉剂，半胱氨酸与NP
‑
40作为非离子活性剂来配合PolyA来释放待测样本的核酸，具体来说，半胱氨酸和NP
‑
40在本方案中：两者作为非离子表面活性剂，可裂解细胞膜，使得核酸快速释放，另外NP
‑
40可对逆转录酶起到保护作用，使得逆转录酶在碱性环境中能正常工作，因此在使用时不需要使用裂解液进行煮沸，也不需要采用离心柱法和磁珠法提取核酸，仅仅只需要将其与待测样本放在PCR反应管内混
合即可得到核酸，因此能够显著降低操作难度、降低操作时间、减少核酸浪费，从而达到提取效率高、操作简单，可在室温下3分钟内完成样本处理及生产成本低的优点；
[0013]2.本方案利用该核酸释放剂释放出来的核酸可直接用于PCR检测，现有技术中有较多关于核酸磁珠提取法的核酸提取剂，然而核酸磁珠提取法还需要配合核酸提取仪以及磁力架进行，且程序一般运行时间在30分钟左右，成本高耗时久，而本方案提供的是可直接释放用于PCR检测的核酸的核酸释放剂。
[0014]3、而且本核酸释放剂的配制方法极为简单，只需要将上述各种成本混合摇匀即可，显著降低了生产成本和配制难度。
[0015]进一步地，由1M Tris
‑
HCl、50mM EDTA、1M半胱氨酸、20U/μL RRI、DEPC水以及体积百分比浓度为25％的NP
‑
40、体积百分比浓度为5％的Poly A组成。
[0016]核酸释放方法，采用上述的核酸释放剂，具体包括以下步骤：
[0017]将所述核酸释放剂平衡至室温后摇匀；
[0018]取摇匀后的所述核酸释放剂加入至PCR反应管；
[0019]再加入待测样本并吹打混匀得到目的核酸，其中所述核酸释放剂与所述待测样本的体积比为1:3。本申请与现有技术相比，无需单独提取样本核酸，只需要将核酸释放剂与待测样本按照1:3的体积比例在PCR反应管内摇匀即可得到目的核酸，彻底免去了现有技术中的离心、弃上清和转管等操作，极大地简化了实验步骤，也因为不存在煮沸以及转移反应容器等操作，因此不存在核酸丢失，使得核酸的回收率极大地提高，也使得检测灵敏度有很大的提高。
[0020]进一步地，所述待测样本包括全血、血清、血浆或分泌物。
[0021]此设置，应用本核酸释放剂可以对全血、血清、血浆或分泌物等未知样本中的核酸含量进行快速、准确的测定，而且重复性好，特异性强，兼容性好。
[0022]进一步地，所述目的核酸为DNA或RNA。
[0023]进一步地，所述核酸释放剂的配制方法如下：
[0024]分别取1μL的1M Tris
‑
HCl、0.4μL的50mM EDTA、0.2μL的1M半胱氨酸、0.2μL的体积百分比浓度为25％的NP
‑
40、0.2μL的体积百分比浓度为5％的Poly A、0.04μL的20U/μL RRI及7.96μL的DEPC水充分混匀制成。
[0025]此设置，证明本申请的核酸释放剂的用量很小，在易于判别的前提下能够保持成本低、使用安全的有点，能够适用于不同类型的荧光定量PCR仪尤其是应用于POCT，可广泛应用于病原微生物的检测、基因突变检测，宠物疾病检测及法医学鉴定等领域。
附图说明
[0026]图1是本专利技术的实施例1的核酸释放剂与磁珠法检测ORF1ab基因的示意图；
[0027]图2是实施例2的核酸释放剂与实施例1的核酸释放剂检测ORF1ab基因的示意图；
[0028]图3是实施例3的核酸释放剂与实施例1的核酸释放剂检测ORF1ab基因的示意图；
[0029]图4是实施例4的核酸释放剂与实施例1的核酸释放剂检测ORF1ab基因的示意图；
[0030]图5是实施例1的核酸释放剂与磁珠法检测N基因的示意图；
[0031]图6是实施例2的核酸释放剂与实施例1的核酸释放剂检测N基因的示意图；
[0032]图7是实施例3的核酸释放剂与实施例1的核酸释放剂检测N基因的示意图；
[0033]图8是实施例4的核酸释放剂与实施例1的核酸释放剂检测N基因的示意图；
[0034]图9是磁珠法检测OR本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.核酸释放剂，其特征在于，包括0.5
‑
1.5M Tris
‑
HCl、30
‑
70mM EDTA、0.5
‑
1.5M半胱氨酸、10
‑
30U/μL RRI、DEPC水以及体积百分比浓度为15
‑
30％的NP
‑
40、体积百分比浓度为3
‑
7％的Poly A，其中RRI为RNA酶抑制剂。2.根据权利要求1所述的核酸释放剂，其特征在于，由1M Tris
‑
HCl、50mM EDTA、1M半胱氨酸、20U/μL RRI、DEPC水以及体积百分比浓度为25％的NP
‑
40、体积百分比浓度为5％的Poly A组成。3.根据权利要求1所述的核酸释放剂，其特征在于，PolyA作为核酸助沉剂，半胱氨酸与NP
‑
40作为非离子活性剂来配合PolyA来释放核酸。4.核酸释放方法，其特征在于，采用权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：焦明超，董伟斌，倪晓龙，
申请(专利权)人：杭州迪安生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：