用于在包含发夹环的多核苷酸模板的末端上产生非对称接头并从其测序的方法技术

一种通过使用发夹或哑铃接头由具有游离5

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于在包含发夹环的多核苷酸模板的末端上产生非对称接头并从其测序的方法
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请按照美国法典第35卷第119条要求2019年10月25日提交的美国临时申请62/926,360的优先权，其公开内容以引用方式并入本文以用于所有目的。


[0003]本公开整体涉及用于在包含发夹环的多核苷酸的末端上产生非对称接头并从其测序的方法。
[0004]以引用方式并入序列表
[0005]本申请随附的是于2020年10月19日创建的名称为“序列表_ST25.txt”的序列表，其具有784字节的数据，在IBM
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PC，MS
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Windows操作系统上进行机器格式化。该序列表据此全文以引用方式并入以用于所有目的。

技术介绍

[0006]采用封闭端双链模板的测序平台理想地需要在测序模板的末端处的两种不同接头序列。此类末端非对称性使得单个测序引物和聚合酶仅结合到封闭端模板的一端，并且每个模板分子仅产生一个序列读数。目前这在标准文库构建的情况下是不可能的，其中相同的序列附加到模板的两端，因此将泊松伪影引入测序中，即，一些模板不具有结合的引物/聚合酶，一些具有一个结合的引物/聚合酶，而一些必须有结合的引物/聚合酶(每一端各一个)。

技术实现思路

[0007]本公开提供了用于在包含发夹环的多核苷酸模板的末端上产生非对称接头的方法。通过启用非对称接头，可避免由标准方法发送的泊松伪影，从而提高测序文库的转化收率。此外，本文所公开的方法简化了文库准备工作流程，并允许在测序平台上进行文库准备的一些步骤。
[0008]在一个实施方案中，本专利技术提供了一种由具有游离5
’
端和3'端的双链核酸模板产生非对称封闭端双链核酸模板的方法，该方法包括：(A)将第一基于核酸的发夹或哑铃接头附接到包含游离5
’
端和3'端的双链核酸模板的3'端；(B)使用进行性聚合酶从所述核酸发夹的每个3'端延伸与双链核酸模板互补的序列，以产生两个长发夹双链体模板，其中该双链体模板的一端包含封闭发夹(“发夹端”)，并且该双链体的另一端包含游离3'
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链端和游离5'
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链端(“自由端”)；(C)通过以下步骤封闭每个长发夹双链体模板的自由端以形成非对称封闭端双链核酸模板：(i)将第二基于核酸的发夹或哑铃接头连接到双链体模板的自由端；或者(ii)使用TelN原核端粒酶封闭该双链体模板的自由端，其中该双链体模板的自由端被设计成包括TelN识别序列。在本文所示实施方案的另一个实施方案中，双链核酸模板是双链DNA模板。在本文所示实施方案的另一个实施方案中，双链核酸模板的5
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端和3'端被
去磷酸化并进行末端修复。在本文所示实施方案的另一个实施方案中，双链核酸模板具有齐平5
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端和3'端。在本文所示实施方案的另一个实施方案中，双链核酸模板具有带A尾的3'端。在本文所示实施方案的另一个实施方案中，使用连接酶将第一基于核酸的发夹或哑铃接头连接到双链核酸模板的3'端。在本文所示实施方案的另一个实施方案中，连接酶为T4 DNA连接酶或T3DNA连接酶。在本文所示实施方案的另一个实施方案中，第一基于核酸的发夹或哑铃接头包含齐平端或T尾端。在本文所示实施方案的另一个实施方案中，第一基于核酸的发夹接头包括Y形接头。在本文所示实施方案的某个实施方案中，由彼此结合的两个第一基于核酸的发夹或哑铃接头形成的二聚体通过使用尺寸选择或尺寸排阻技术去除。在本文所示实施方案的另一实施方案中，进行性聚合酶为Phi29聚合酶。在本文所示实施方案的另一个实施方案中，第二基于核酸的发夹或哑铃接头包含齐平端或T尾端。在本文所示实施方案的另一个实施方案中，在步骤(C)之前，用产生5
’
悬端的限制性酶消化所述长发夹双链体模板。在本文所示实施方案的另一个实施方案中，在步骤(C)之前，用产生3
’
悬端的限制性酶消化所述长发夹双链体模板。在本文所示实施方案的另一个实施方案中，第二基于核酸的发夹或哑铃接头包含悬端序列，所述悬端序列与经消化的长发夹双链体模板的悬端序列互补。在本文所示实施方案的另一个实施方案中，使用多核苷酸激酶和连接酶将第二基于核酸的发夹或哑铃接头连接到双链体模板的自由端。在本文所示实施方案的另一个实施方案中，由彼此结合的两个第二基于核酸的发夹或哑铃接头形成的二聚体通过使用尺寸选择或尺寸排阻技术去除。在本文所示实施方案的另一个实施方案中，TelN原核端粒酶来自噬菌体N15，并且TelN原核端粒酶在TelN识别序列处切割该长发夹双链体模板，并且在该切割位点处留下共价封闭端。在本文所示实施方案的另一个实施方案中，本文所公开的方法还包括以下步骤：(C')使用滚环复制产生包含多顺反子扩增的非对称封闭端双链核酸模板的纳米球复合物。在本文所示实施方案的另一个实施方案中，本文所公开的方法还包括以下步骤：(D)使用测序引物和聚合酶对非对称封闭端双链核酸模板或纳米球复合物进行测序。在本文所示实施方案的另一个实施方案中，步骤(B)、步骤(C)(ii)和步骤(D)可作为一锅反应组合在一起。在本文所示实施方案的另一个实施方案中，步骤(B)、步骤(C)(ii)和步骤(D)在自动测序平台的孔中进行。
[0009]在某个实施方案中，本公开还提供了一种由包含互补发夹环的标记DNA产生非对称双链核酸模板的方法，该方法包括：(I)产生在每条链的5'端处包含互补发夹环的标记DNA，其中所述发夹环包含碱基配对转座酶识别序列，并且其中在所述标记DNA的5'端和3'端之间存在单链序列的空位；(II)使用空位
‑
填充
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连接反应填充标记DNA的5'端和3'端之间的空位以形成封闭端标记DNA；(III)在封闭端标记DNA的每个发夹区域处在顶链中产生切口；(IV)使用进行性聚合酶从每个切口延伸与双链核酸模板互补的序列以产生两个长发夹双链体模板，其中该双链体模板的一端包含封闭发夹(“发夹端”)，并且该双链体的另一端包含3'链端和5'链端(“自由端”)；(V)通过以下步骤封闭每个长发夹双链体模板的自由端以形成非对称封闭端双链核酸模板：(a)将基于核酸的发夹或哑铃接头连接到双链体模板的自由端；或者(b)使用TelN原核端粒酶封闭该双链体模板的自由端，其中该双链体模板的自由端被设计成包括TelN识别序列。在本文所示实施方案的另一个实施方案中，转座酶识别序列为19
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bp Mosaic末端序列。在本文所示实施方案的另一个实施方案中，空位的长度为9个碱基对。在本文所示实施方案的另一个实施方案中，空位
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填充
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连接反应包含
Klenow片段。在本文所示实施方案的另一个实施方案中，空位
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填充
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连接反应包含T4 DNA聚合酶和Ampligase。在本文所示实施方案的某个实施方案中，切口通过使用位点特异性核酸内切酶产生。在本本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种由具有游离5
’
端和3'端的双链核酸模板产生非对称封闭端双链核酸模板的方法，所述方法包括：(A)将第一基于核酸的发夹或哑铃接头附接到包含游离5
’
端和3'端的双链核酸模板的3'端；(B)使用进行性聚合酶从与所述双链核酸模板互补的核酸发夹或哑铃序列的每个3'端延伸，以产生两个长发夹双链体模板，其中所述双链体模板的一端包含封闭发夹(“发夹端”)，并且所述双链体的另一端包含游离3'
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链端和游离5'
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链端(“自由端”)；以及(C)通过以下步骤封闭每个长发夹双链体模板的自由端以形成非对称封闭端双链核酸模板：(i)将第二基于核酸的发夹或哑铃接头连接到所述双链体模板的自由端；或者(ii)使用TelN原核端粒酶封闭所述双链体模板的自由端，其中所述双链体模板的自由端被设计成包括TelN识别序列。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述双链核酸模板是双链DNA模板。3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述双链核酸模板的5
’
端和3'端被去磷酸化并进行末端修复。4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述双链核酸模板具有齐平5
’
端和3
’
端。5.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述双链核酸模板具有带A尾的3'端。6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中使用连接酶将所述第一基于核酸的发夹或哑铃接头连接到所述双链核酸模板的3'端。7.根据权利要求6所述的方法，其中所述连接酶为T4 DNA连接酶或T3 DNA连接酶。8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一基于核酸的发夹或哑铃接头包含齐平端或T尾端。9.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述第一基于核酸的发夹接头为Y形接头。10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中由彼此结合的两个第一基于核酸的发夹或哑铃接头形成的二聚体通过使用尺寸选择或尺寸排阻技术来去除。11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述进行性聚合酶为Phi29聚合酶。12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第二基于核酸的发夹或哑铃接头包含齐平端或T尾端。13.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中在步骤(C)之前，用产生5
’
悬端的限制性酶消化所述长发夹双链体模板。14.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中在步骤(C)之前，用产生3
’
悬端的限制性酶消化所述长发夹双链体模板。15.根据权利要求13或14所述的方法，其中所述第二基于核酸的发夹或哑铃接头包含悬端序列，所述悬端序列与所述经消化的长发夹双链体模板的悬端序列互补。16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中使用多核苷酸激酶和连接酶将所述第二基于核酸的发夹或哑铃接头连接到所述双链体模板的自由端。17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中由彼此结合的两个第二基于核酸的
发夹或哑铃接头形成的二聚体通过使用尺寸选择或尺寸排阻技术来去除。18.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述TelN原核端粒酶来自噬菌体N15，并且所述TelN原核端粒酶在所述TelN识别序列处切割所述长发夹双链体模板，并且在所述切割位点处留下共价封闭端。19.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法还包括以下步骤：(C')使用滚环复制产生包含多顺反子扩增的非对称封闭端双链核酸模板的纳米球复合物。20.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法还包括以下步骤：(D)使用测序引物和聚合酶对所述非对称封闭端双链核酸模板或纳米球复合物进行测序。21.根据权利要求20所述的方法，其中步骤(B)、步骤(C)(ii)和步骤(D)可作为一锅反应组合在一起。22.根据权利要求20所述的方法，其中步骤(B)、步骤(C)(ii)和步骤(D)在自动测序平台的孔中进行。23.一种由包含互补发夹环的标记DNA产生非对称双链核酸模板的方法，所述方法包括：(I)产生在每条链的5'端处包含互补发夹环的标记DNA，其中所述发夹环包含碱基配对转座酶识别序列，并且其中在所述标记DNA的5'端和3'端之间存在单链序列的空位；(II)使用空位
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填充
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【专利技术属性】
技术研发人员：N，
申请(专利权)人：因美纳剑桥有限公司，
类型：发明
国别省市：