一种利用含有硒代半胱氨酸的GPI锚定蛋白表达系统及高表达重组蛋白的细胞技术方案

本发明专利技术公开了一种利用含有硒代半胱氨酸的GPI锚定蛋白表达系统及高表达重组蛋白的细胞。其通过准备载体、连接特定蛋白、定点诱变、插入SECIS、更换至pME

【技术实现步骤摘要】
一种利用含有硒代半胱氨酸的GPI锚定蛋白表达系统及高表达重组蛋白的细胞


[0001]本专利技术涉及细胞工程
，特别是涉及一种利用含有硒代半胱氨酸的GPI锚定蛋白表达系统及高表达重组蛋白的细胞。

技术介绍

[0002]利用哺乳动物细胞生产重组蛋白受到了越来越多的关注，因为它们越来越多地被用于生物制药和临床研究。哺乳动物细胞系，例如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)，幼仓鼠肾细胞，小鼠骨髓瘤细胞和人胚肾293(HEK293)细胞，由于其合适的蛋白折叠、组装和翻译后修饰能力，已被广泛用于重组蛋白的生产。近年来药物蛋白的需求量逐年增加，目前提高生产率主要通过提高基因转染效率和基因扩增率，宿主细胞工程，培养基优化及工艺工程和开发。但是，高产细胞株的筛选和选择仍然基于基因整合，其次是药物选择或荧光激活细胞分选(FACS)。此外，大多数重组药物蛋白是分泌蛋白，难以从大量细胞中选择高产细胞系。因此，大规模生产仍然是耗时耗力的工作。通过选择系统的进一步改进，仍然存在提高生产率的机会。
[0003]哺乳动物细胞中，大多数膜蛋白通过糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚固定在细胞表面。GPI锚定蛋白(GPI
‑
APs)在内质网中合成。具有GPI信号的蛋白质被识别，切割，然后GPI通过由PIGK，GPAA1，PIGS，PIGT和PIGU组成的GPI转酰胺酶复合物转移到新生蛋白质C末端。PIGK是GPI转酰胺酶的催化亚基。破坏PIGK会导致GPI
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AP表面表达缺失。当将GPI附着信号添加到分泌蛋白的C末端时，这些蛋白就表示为GPI
‑
AP。因此，有可能通过GPI锚定在细胞表面表达广泛的分泌型重组蛋白。
[0004]硒是具有重要生物医学潜力的必需微量元素，被掺入硒蛋白中存在的氨基酸硒代半胱氨酸。硒蛋白在各种器官中被广泛认为是抗氧化剂。硒缺乏会引起多种疾病，包括不育，发育迟缓和免疫力低下。编码硒蛋白的基因在3'端非翻译区(UTR)中包含Sec插入序列(SECIS)，这对于识别框内密码子UGA(通常是终止密码子)作为掺入Sec残基的信号是必不可少的。SECIS元素和框架内UGA密码子的组合已用于鉴定多种生物中的硒蛋白质组。硒对于阻止SARS病毒病毒突变有独特作用。此外，病毒可使人体产生大量自由基，造成一系列连锁反应，而硒的强大清除自由基作用可破坏这一循环，从而保护脏器不受侵害。美国西弗吉尼亚大学医学院的研究者们建议每天服用200微克硒，以提高人体免疫力，对抗“非典”。此外，缺硒人群食欲较差，也是导致其缺硒和抗病能力下降的原因之一。研究还发现，适量补硒可有效减轻焦虑、抑郁和疲倦，利于机体康复。美国国家科学院食物营养协会推荐10岁以上儿童及成人每人每日硒的摄入量宜在50
‑
200微克。目前临床推荐的安全使用剂量为5ug/kg
·
d体重(治疗量)。一般认为，成人对硒的正常生理需要量为60
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400ug/d。长期过量服用硒可导致脱发、指甲和皮肤变暗等。我国从东北到西南存在着一条缺硒地带，这些低硒地区人群每日硒摄入量不足10ug，从而导致多种疾病发生。如江苏省启东县为贫硒地区，当地居民血硒水平仅(0.076
±
0.0237)ug/ml，导致肝炎及肝癌高发。目前，许多国家正积极开发有
机硒。与无机硒相比，硒蛋白具有生物利用度高、生理活性强、毒性低等特点。

技术实现思路

[0005]鉴于上述的技术缺陷，提出了本专利技术。
[0006]因此，作为本专利技术其中一个方面，本专利技术克服现有技术中存在的不足，提供一种利用含有硒代半胱氨酸的GPI锚定蛋白表达系统筛选高表达重组蛋白的细胞。
[0007]为解决上述技术问题，本专利技术提供了如下技术方案：一种含有硒代半胱氨酸的GPI锚定蛋白表达系统的制备方法，其包括，编码硒蛋白的基因在3'端非翻译区UTR的Sec插入序列SECIS，能识别开放阅读框内终止密码子TGA并翻译成硒代半胱氨酸；制备pME
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Hyg
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sHF
‑
特定蛋白
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Sec
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GPI
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SECIS；扩增人SELT基因的SECIS序列，并将特定蛋白基因序列与密码子TGA和人源CD59蛋白的GPI修饰序列及终止密码子TAA插入到NotI位点之后，即构建了含有硒代半胱氨酸的GPI锚定蛋白表达系统。
[0008]作为本专利技术所述的含有硒代半胱氨酸的GPI锚定蛋白表达系统的制备方法的优选方案，其中：所述特定蛋白包括重组溶酶体酸性脂肪酶、α
‑
半乳糖苷酶A中的一种或几种。
[0009]作为本专利技术所述的含有硒代半胱氨酸的GPI锚定蛋白表达系统的制备方法的优选方案，其中：所述sHF表示为内质网信号序列加上带有His
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FLAG
‑
标签。
[0010]作为本专利技术所述的含有硒代半胱氨酸的GPI锚定蛋白表达系统的制备方法的优选方案，其中：还包括，将所述质粒转染到HEK293细胞中，并敲除PIGK基因。
[0011]作为本专利技术所述的含有硒代半胱氨酸的GPI锚定蛋白表达系统的制备方法的优选方案，其中：所述敲除PIGK基因，其包括，使用CRISPR/Cas9系统将HEK293细胞中的PIGK基因敲除；制备pX330
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EGFP
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PIGK
‑
KO，转染后，获得PIGK
‑
KO细胞；将pPB
‑
FRT
‑
PGKp
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PurodTK插入到PIGK
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KO细胞的基因组中；制备pPB
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FRT
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PurodTK
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PIGK；将pPB
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FRT
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PurodTK
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PIGK与pCMV
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hyPBase共转染到PIGK
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KO细胞中，用嘌呤霉素进行培养；加入pCMV
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hyPBase和/或pCAG
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FLBase
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IRES
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puroDNA，再用含MFIAU的培养基培养即可。
[0012]作为本专利技术所述的含有硒代半胱氨酸的GPI锚定蛋白表达系统的制备方法的优选方案，其中：所述带有PIGK
‑
KO细胞不具有WT等位基因。
[0013]作为本专利技术的另一方面，本专利技术提供一种含有硒代半胱氨酸的GPI锚定蛋白表达系统的诱导方法，其包括：加入硒元素诱导转染后的HEK293细胞的细胞膜表面GPI形式的蛋白表达，所述硒元素来源于亚硒酸钠。
[0014]作为本专利技术所述的含有硒代半胱氨酸的GPI锚定蛋白表达系统的诱导方法的优选方案，其中：所述亚硒酸钠的浓度为1～3μM，对应的所述转染后的HEK293细胞的密度为1...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种含有硒代半胱氨酸的GPI锚定蛋白表达系统的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：准备载体：准备载体pME
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Puro
‑
sHF
‑
GPI，其带有一个嘌呤霉素抗性基因(Puro)，一个带有信号肽的his和Flag标签基因(sHF)以及GPI修饰信号序列；连接特定蛋白：将特定基因序列通过In
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fusion同源重组连接到载体pME
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Puro
‑
sHF
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GPI上，生成质粒pME
‑
Puro
‑
ssHF
‑
特定蛋白
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GPI；定点诱变：通过定点诱变技术将终止密码子TGA插入pME
‑
Puro
‑
ssHF
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特定蛋白
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GPI的GPI修饰信号序列之前生成质粒pME
‑
Puro
‑
sHF
‑
特定蛋白
‑
TGA
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GPI；插入SECIS：插入人SELT基因的SECIS基因到NotI之前，当SECIS存在时，翻译过程中，终止密码子TGA转化为硒代半胱氨酸(Sec)，pME
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Puro
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sHF
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特定蛋白
‑
TGA
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GPI在插入SECIS后为pME
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Puro
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sHF
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特定蛋白
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Sec
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GPI
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SECIS质粒；更换至pME
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Hyg：通过限制性内切酶EcoRI和NotI将pME
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Hyg与sHF
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特定蛋白
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Sec
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GPI
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SECIS相连接，生成pME
‑
Hyg
‑
sHF
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特定蛋白
‑
Sec
‑
GPI
‑
SECIS质粒。2.根据权利要求1中所述的含有硒代半胱氨酸的GPI锚定蛋白表达系统的制备方法，其特征在于：所述特定蛋白包括重组溶酶体酸性脂肪酶、α
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半乳糖苷酶A中的一种或几种。3.根据权利要求1中所述的含有硒代半胱氨酸的GPI锚定蛋白表达系统的制备方法，其特征在于：所述sHF表示为内质网信号序列加上带有His
‑
FLAG
‑
标签。4.如权利要求1～3任一所述的含有硒代半胱氨酸的GPI锚定蛋白表达系统的制备方法，其特征在于：还包括，将所述质粒转染到HEK293细胞中，并敲除PIGK基因。5.如权利要求4所述的含有硒代半胱氨酸的GPI锚定蛋白表达系统的制备方法，其特征在于：所述敲除PIGK基因，其包括，使用CRISPR/Cas9系统将HEK293细胞中PIGK基因敲除；制备pX330
‑
EGFP
‑
PIGK
‑
KO，转染后，获得PIGK
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KO细胞；将pPB
‑
FRT
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PGKp
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PurodTK插入到PIGK
‑
KO细胞的基因组中；制备pPB
‑
FRT
‑
PurodTK<...

【专利技术属性】
技术研发人员：藤田盛久，柳艺石，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：