包括人源化白蛋白基因座的非人动物制造技术

提供了包括人源化白蛋白(ALB)基因座的非人动物基因组、非人动物细胞和非人动物以及制备和使用此类非人动物基因组、非人动物细胞和非人动物的方法。包括人源化白蛋白基因座的非人动物细胞或非人动物表达人白蛋白或嵌合白蛋白，所述嵌合白蛋白的片段来自人白蛋白。提供了用于使用包括人源化白蛋白基因座的此类非人动物来评估如核酸酶药剂等被设计成靶向人白蛋白的人白蛋白靶向试剂的体内功效的方法。法。法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】包括人源化白蛋白基因座的非人动物
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求于2019年6月7日提交的美国申请第62/858,589号和于2019年10月17日提交的美国申请第62/916,666号的权益，所述美国申请中的每个美国申请出于所有目的通过引用整体并入本文。
[0003]序列表的引用通过EFS WEB作为文本文件提交
[0004]写入文件548157SEQLIST.txt中的序列表为158千字节，创建于2020年5月27日，并且特此通过引用并入。

技术介绍

[0005]基因疗法是一种很有前景的用于若干种人疾病的治疗方法。关于基因疗法的一种方法是将转基因插入到基因组中的安全港基因座中。安全港基因座包含染色体基因座，在所述染色体基因座中，转基因或其它外源核酸插入物可以在所有所关注组织中稳定且可靠地表达，而不会明显改变细胞行为或表型。通常，安全港基因座是其中所插入基因序列的表达不受来自相邻基因的任何通读表达干扰的基因座。例如，安全港基因座可以包含染色体基因座，在所述染色体基因座中，外源DNA可以以可预测的方式整合和发挥作用，而不会对内源性基因结构或表达产生不利影响。安全港基因座可以包含基因外区域或基因内区域，例如非必需、可有可无或能够在没有明显表型结果的情况下破裂的基因内的基因座。
[0006]安全港基因座的实例是白蛋白。然而，仍然需要合适的非人动物，所述非人动物在体内提供人白蛋白靶向试剂在内源性白蛋白基因座处的真实人基因组DNA靶标的真实或紧密近似，由此能够测试此类药剂在活体动物中的功效和作用模式以及在人源化基因是存在的白蛋白的唯一版本的背景下的药代动力学和药效动力学研究。

技术实现思路

[0007]提供了包括人源化白蛋白(ALB)基因座的非人动物以及制备和使用此类非人动物的方法。还提供了包括人源化白蛋白(ALB)基因座的非人动物基因组或细胞。还提供了人源化白蛋白基因。
[0008]一方面，提供了包括人源化白蛋白(ALB)基因座的非人动物基因组、非人动物细胞或非人动物。此类非人动物基因组、非人动物细胞或非人动物可以在其基因组中包括人源化内源性白蛋白基因座，其中所述内源性白蛋白基因座的区段已经缺失并且被对应人白蛋白序列替代。
[0009]在一些此类非人动物基因组、非人动物细胞或非人动物中，所述人源化内源性白蛋白基因座编码包括人血清白蛋白肽的蛋白质。在一些此类非人动物基因组、非人动物细胞或非人动物中，所述人源化内源性白蛋白基因座编码包括人白蛋白前肽的蛋白质。在一些此类非人动物基因组、非人动物细胞或非人动物中，所述人源化内源性白蛋白基因座编码包括人白蛋白信号肽的蛋白质。
[0010]在一些此类非人动物基因组、非人动物细胞或非人动物中，所述内源性白蛋白基
因座的包括编码序列和非编码序列两者的区域已经缺失并且被包括编码序列和非编码序列两者的对应人白蛋白序列替代。在一些此类非人动物基因组、非人动物细胞或非人动物中，所述人源化内源性白蛋白基因座包括内源性白蛋白启动子，其中所述人白蛋白序列与所述内源性白蛋白启动子可操作地连接。在一些此类非人动物基因组、非人动物细胞或非人动物中，所述内源性白蛋白基因座的至少一个内含子和至少一个外显子已经缺失并且被所述对应人白蛋白序列替代。
[0011]在一些此类非人动物基因组、非人动物细胞或非人动物中，所述内源性白蛋白基因座的整个白蛋白编码序列已经缺失并且被所述对应人白蛋白序列替代。任选地，所述内源性白蛋白基因座的从起始密码子到终止密码子的区域已经缺失并且被所述对应人白蛋白序列替代。
[0012]在一些此类非人动物基因组、非人动物细胞或非人动物中，所述人源化内源性白蛋白基因座包括人白蛋白3'非翻译区。在一些此类非人动物基因组、非人动物细胞或非人动物中，所述内源性白蛋白5'非翻译区尚未缺失并且尚未被所述对应人白蛋白序列替代。
[0013]在一些此类非人动物基因组、非人动物细胞或非人动物中，所述内源性白蛋白基因座的从起始密码子到终止密码子的区域已经缺失并且被包括所述对应人白蛋白序列和人白蛋白3'非翻译区的人白蛋白序列替代，并且所述内源性白蛋白5'非翻译区尚未缺失并且尚未被所述对应人白蛋白序列替代，并且所述内源性白蛋白启动子尚未缺失并且尚未被所述对应人白蛋白序列替代。
[0014]在一些此类非人动物基因组、非人动物细胞或非人动物中，所述人源化内源性白蛋白基因座处的所述人白蛋白序列包括与SEQ ID NO:35中所示的序列至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一些此类非人动物基因组、非人动物细胞或非人动物中，所述人源化内源性白蛋白基因座编码包括与SEQ ID NO:5中所示的序列至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列的蛋白质。在一些此类非人动物基因组、非人动物细胞或非人动物中，所述人源化内源性白蛋白基因座包括编码序列，所述编码序列包括与SEQ ID NO:13中所示的序列至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一些此类非人动物基因组、非人动物细胞或非人动物中，所述人源化内源性基因座包括与SEQ ID NO:17或18中所示的序列至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一些此类非人动物基因组、非人动物细胞或非人动物中，所述人源化内源性白蛋白基因座处的所述人白蛋白序列包括与SEQ ID NO:35中所示的序列至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的序列。在一些此类非人动物基因组、非人动物细胞或非人动物中，所述人源化内源性白蛋白基因座编码包括与SEQ ID NO:5中所示的序列至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的序列的蛋白质。在一些此类非人动物基因组、非人动物细胞或非人动物中，所述人源化内源性白蛋白基因座包括编码序列，所述编码序列包括与SEQ ID NO:13中所示的序列至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的序列。在一些此类非人动物基因组、非人动物细胞或非人动物中，所述人源化内源性白蛋白基因座包括与SEQ ID NO:17或18中所示的序列至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的序列。
[0015]在一些此类非人动物基因组、非人动物细胞或非人动物中，所述人源化内源性白蛋白基因座不包括选择盒或报告基因。
[0016]在一些此类非人动物基因组、非人动物细胞或非人动物中，所述非人动物对于所述人源化内源性白蛋白基因座是纯合的。在一些此类非人动物基因组、非人动物细胞或非人动物中，所述非人动物在其种系中包括所述人源化内源性白蛋白基因座。
[0017]在一些此类非人动物基因组、非人动物细胞或非人动物中，所述非人动物是哺乳动物。任选地，非人动物是大鼠或小本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种非人动物，其在其基因组中包括人源化内源性白蛋白基因座，其中所述内源性白蛋白基因座的区段已经缺失并且被对应人白蛋白序列替代。2.根据权利要求1所述的非人动物，其中所述人源化内源性白蛋白基因座编码包括人血清白蛋白肽的蛋白质。3.根据权利要求1或2所述的非人动物，其中所述人源化内源性白蛋白基因座编码包括人白蛋白前肽的蛋白质。4.根据前述权利要求中任一项所述的非人动物，其中所述人源化内源性白蛋白基因座编码包括人白蛋白信号肽的蛋白质。5.根据前述权利要求中任一项所述的非人动物，其中所述内源性白蛋白基因座的包括编码序列和非编码序列两者的区域已经缺失并且被包括编码序列和非编码序列两者的对应人白蛋白序列替代。6.根据前述权利要求中任一项所述的非人动物，其中所述人源化内源性白蛋白基因座包括内源性白蛋白启动子，其中所述人白蛋白序列与所述内源性白蛋白启动子可操作地连接。7.根据前述权利要求中任一项所述的非人动物，其中所述内源性白蛋白基因座的至少一个内含子和至少一个外显子已经缺失并且被所述对应人白蛋白序列替代。8.根据前述权利要求中任一项所述的非人动物，其中所述内源性白蛋白基因座的整个白蛋白编码序列已经缺失并且被所述对应人白蛋白序列替代。9.根据权利要求8所述的非人动物，其中所述内源性白蛋白基因座的从起始密码子到终止密码子的区域已经缺失并且被所述对应人白蛋白序列替代。10.根据前述权利要求中任一项所述的非人动物，其中所述人源化内源性白蛋白基因座包括人白蛋白3'非翻译区。11.根据前述权利要求中任一项所述的非人动物，其中内源性白蛋白5'非翻译区尚未缺失并且尚未被所述对应人白蛋白序列替代。12.根据前述权利要求中任一项所述的非人动物，其中所述内源性白蛋白基因座的从所述起始密码子到所述终止密码子的所述区域已经缺失并且被包括所述对应人白蛋白序列和人白蛋白3'非翻译区的人白蛋白序列替代，并且其中所述内源性白蛋白5'非翻译区尚未缺失并且尚未被所述对应人白蛋白序列替代，并且其中所述内源性白蛋白启动子尚未缺失并且尚未被所述对应人白蛋白序列替代。13.根据前述权利要求中任一项所述的非人动物，其中：(i)所述人源化内源性白蛋白基因座处的所述人白蛋白序列包括与SEQ ID NO:35中所示的序列至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的序列；或(ii)所述人源化内源性白蛋白基因座编码包括与SEQ ID NO:5中所示的序列至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％相同的序列的蛋白质；(iii)所述人源化内源性白蛋白基因座包括编码序列，所述编码序列包括与SEQ ID NO:13中所示的序列至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％
相同的序列；或(iv)所述人源化内源性白蛋白基因座包括与SEQ ID NO:17或18中所示的序列至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的序列。14.根据前述权利要求中任一项所述的非人动物，其中所述人源化内源性白蛋白基因座不包括选择盒或报告基因。15.根据前述权利要求中任一项所述的非人动物，其中所述非人动物对于所述人源化内源性白蛋白基因座是纯合的。16.根据前述权利要求中任一项所述的非人动物，其中所述非人动物在其种系中包括所述人源化内源性白蛋白基因座。17.根据前述权利要求中任一项所述的非人动物，其中所述非人动物是哺乳动物。18.根据权利要求17所述的非人动物，其中所述非人动物是大鼠或小鼠。19.根据权利要求18所述的非人动物，其中所述非人动物是小鼠。20.根据前述权利要求中任一项所述的非人动物，其中所述非人动物对于所述人源化内源性白蛋白基因座是纯合的。21.根据权利要求1到19中任一项所述的非人动物，其中所述非人动物对于所述人源化内源性白蛋白基因座是杂合的。22.根据前述权利要求中任一项所述的非人动物，其中所述非人动物的血清白蛋白水平为至少约10mg/mL。23.根据前述权利要求中任一项所述的非人动物，其中所述非人动物的血清白蛋白水平至少与包括野生型白蛋白基因座的对照非人动物的血清白蛋白水平一样高。24.根据前述权利要求中任一项所述的非人动物，其中所述非人动物进一步包括整合到所述非人动物的一个或多个细胞中的所述人源化内源性白蛋白基因座的至少一个等位基因中的外源性蛋白的编码序列。25.根据权利要求24所述的非人动物，其中所述外源性蛋白的所述编码序列整合到所述非人动物的所述一个或多个细胞中的所述人源化内源性白蛋白基因座的所述至少一个等位基因的内含子1中。26.根据前述权利要求中任一项所述的非人动物，其中所述非人动物进一步包括不是所述内源性白蛋白基因座的灭活内源性基因座。27.根据权利要求26所述的非人动物，其中所述非人动物进一步包括整合到所述非人动物的一个或多个细胞中的所述人源化内源性白蛋白基因座的至少一个等位基因中的外源性蛋白的编码序列，其中所述外源性蛋白替代所述灭活内源性基因座的功能。28.根据权利要求26或27所述的非人动物，其中所述灭活内源性基因座是灭活F9基因座。29.一种非人动物细胞，其在其基因组中包括人源化内源性白蛋白基因座，其中所述内源性白蛋白基因座的区段已经缺失并且被对应人白蛋白序列替代。30.一种非人动物基因组，其包括人源化内源性白蛋白基因座，其中所述内源性白蛋白基因座的区段已经缺失并且被对应人白蛋白序列替代。31.一种人源化非人动物白蛋白基因，其中所述非人白蛋白基因的区段已经缺失并且被对应人白蛋白序列替代。
32.一种用于产生人源化内源性白蛋白基因座的靶向载体，其中所述内源性白蛋白基因座的区段已经缺失并且被对应人白蛋白序列替代，其中所述靶向载体包括插入核酸，所述插入核酸包括侧接有靶向所述内源性白蛋白基因座处的5'靶序列的5'同源臂和靶向所述内源性白蛋白基因座处的3'靶序列的3'同源臂的所述对应人白蛋白序列。33.一种评估人白蛋白靶向试剂的体内活性的方法，所述方法包括：(a)向根据权利要求1到28中任一项所述的非人动物施用所述人白蛋白靶向试剂；以及(b)评估所述人白蛋白靶向试剂在所述非人动物中的活性。34.根据权利要求33所述的方法，其中所述施用包括腺相关病毒(AAV)介导的递送、脂质纳米颗粒(LNP)介导的递送或流体动力学递送(HDD)。35.根据权利要求34所述的方法，其中所述施用包括LNP介导的递送。36.根据权利要求35所述的方法，其中LNP剂量介于约0.1mg/kg与约2mg/kg之间。37.根据权利要求34所述的方法，其中所述施用包括AAV8介导的递送。38.根据权利要求33到37中任一项所述的方法，其中步骤(b)包括从所述非人动物中分离肝脏并且评估所述人白蛋白靶向试剂在所述肝脏中的活性。39.根据权利要求33到38中任一项所述的方法，其中所述人白蛋白靶向试剂是基因组编辑药剂，并且所述评估包括评估对所述人源化内源性白蛋白基因座的修饰。40.根据权利要求39所述的方法，其中所述评估包括测量所述人源化内源性白蛋白基因座内的插入或缺失的频率。41.根据权利要求33到40中任一项所述的方法，其中所述评估包括测量由所述人源化内源性白蛋白基因座编码的白蛋白信使RNA的表达。42.根据权利要求33到41中任一项所述的方法，其中所述评估包括测量由所述人源化内源性白蛋白基因座编码的白蛋白的表达。43.根据权利要求42所述的方法，其中评估所述白蛋白的表达包括测量所述白蛋白在所述非人动物中的血清水平。44.根据权利要求42所述的方法，其中评估所述白蛋白的表达包括测量所述白蛋白在所述非人动物的所述肝脏中的表达。45.根据权利要求33到43中任一项所述的方法，其中所述人白蛋白靶向试剂包括核酸酶药剂或编码所述核酸酶药剂的核酸，其中所述核酸酶药剂被设计成靶向人白蛋白基因的区域。46.根据权利要求45所述的方法，其中所述核酸酶药剂包括Cas蛋白和被设计成靶向所述人白蛋白基因中的向导RNA靶序列的向导RNA。47.根据权利要求46所述的方法，其中所述向导RNA靶序列位于所述人白蛋白基因的内含子1中。48.根据权利要求46或47所述的方法，其中所述Cas蛋白是Cas9蛋白。49.根据权利要求33到48中任一项所述的方法，其中所述人白蛋白靶向试剂包括外源性供体核酸，其中所述外源性供体核酸被设计成靶向所述人白蛋白基因，并且任选地其中所述外源性供体核酸是通过AAV递送的。50.根据权利要求49所述的方法，其中所述外源...

【专利技术属性】
技术研发人员：方青，家珍，
申请(专利权)人：瑞泽恩制药公司，
类型：发明
国别省市：