一种自组装抗菌肽纳米粒子及其应用制造技术

本发明专利技术涉及抗菌肽技术领域，具体涉及一种自组装抗菌肽纳米粒子及其应用。本发明专利技术提供的抗菌肽具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。该抗菌肽具有广谱抗菌活性，同时具有强蛋白酶稳定性，该抗菌肽能够自组装形成肽纳米粒子，能够抵抗糜蛋白酶和胰蛋白酶作用，可应用于蛋白酶存在的复杂生理环境中，对细菌感染性疾病发挥治疗作用，且该抗菌肽在高于MIC浓度下显示出较低的溶血活性，具备良好的临床应用价值。值。

【技术实现步骤摘要】
一种自组装抗菌肽纳米粒子及其应用


[0001]本专利技术涉及抗菌肽
，具体涉及一种自组装抗菌肽纳米粒子及其应用。

技术介绍

[0002]近几十年来，由于抗生素的频繁和不规则使用使细菌耐药性问题成为公共卫生问题，严重威胁着人类健康和生命安全。虽然目前各国政府普遍加强了对抗生素的监管，但仅仅依靠公共卫生系统的变革难以扭转细菌耐药性的发展趋势。因此，寻找合适的抗生素替代物是目前急需解决的问题。抗菌肽是一类具有抗菌活性的小分子物质，由于其良好的生物相容性和独特的膜破坏机制，使其成为抗生素替代物的理想选择。
[0003]虽然目前关于抗菌肽的研究取得了一定的进展，研究人员已经获得了抗菌活性较强，毒性较弱的高选择性抗菌肽，但是，目前大部分抗菌肽的使用局限于治疗皮肤和伤口细菌感染，其使用范围受到抗菌肽的弱蛋白酶稳定性的严重限制。因此，需要开发具备高蛋白酶稳定性的抗菌肽。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的之一是提供一种抗菌肽，该抗菌肽具有强蛋白酶稳定性，并且自组装为肽纳米粒子。本专利技术还提供该抗菌肽、肽纳米粒子的应用及其相应的产品。
[0005]本专利技术的抗菌肽的整体设计构思如下：在肽的氨基酸序列中加入正电荷氨基酸，并选择具有强膜渗透和破坏能力的精氨酸为肽提供电荷，使其与菌膜发生静电作用；然而，精氨酸存在易被动物体内存在的胰蛋白酶酶解的问题，而且胰蛋白酶能同时识别三个氨基酸。因此，为了在序列设计上最大程度地规避胰蛋白酶的酶切位点，选择在精氨酸两侧放置脯氨酸，形成“PRP”组合；进一步地在序列中额外加入疏水性氨基酸保证肽与菌膜具备更强的亲和力，经筛选，最终确定加入三个亮氨酸，亮氨酸的引入使抗菌肽获得更强的膜
‑
界面亲和力，有助于肽深入膜中，提高肽对细菌的选择性通透能力。另外，考虑到亮氨酸对糜蛋白酶敏感，在每个亮氨酸的C端放置脯氨酸，在序列排布上规避糜蛋白酶的裂解作用。具有上述序列的抗菌肽具有较强的抗菌活性和蛋白酶稳定性。另外，在抗菌肽N末端引入棕榈酸修饰后，棕榈酸能够进一步增强抗菌肽的疏水性，增强抗菌肽破坏菌膜的能力。此外，棕榈酸为肽的组装提供了动力，自组装形成纳米结构能够使抗菌肽的氨基酸侧链堆积更加紧密，增加了空间位阻，阻碍蛋白酶与酶切位点相互作用，进一步降低序列中氨基酸侧链被蛋白酶识别的几率，延长了抗菌肽在蛋白酶存在下的半衰期。
[0006]最终，在序列的C末端进行酰胺化修饰，进一步提高肽的稳定性。
[0007]本专利技术提供一种抗菌肽，其具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
[0008]优选地，以上所述的抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0009]优选地，所述抗菌肽的N末端含有棕榈酸修饰。
[0010]优选地，所述抗菌肽的C末端含有酰胺化修饰。
[0011]具体地，所述抗菌肽的序列和修饰如下：C16
‑
LPLPLPRPRPRPRPRPRP
‑
NH2。其中，C16
代表棕榈酸修改，NH2代表酰胺化修饰。
[0012]本专利技术还提供由所述抗菌肽自组装形成的肽纳米粒子。
[0013]本专利技术还提供以上所述的抗菌肽或肽纳米粒子的衍生物，其将所述抗菌肽或所述肽纳米粒子与载体连接形成的偶联物。
[0014]本专利技术提供的肽纳米粒子具有广谱抗菌活性，对于革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均具有良好的抗菌活性，包括肠杆菌属细菌、葡萄球菌属细菌等。而且，该抗菌肽纳米粒子具有较高的蛋白酶稳定性和较低的细胞毒性。
[0015]基于抗菌肽的功能，本专利技术提供所述抗菌肽或所述肽纳米粒子或所述抗菌肽的衍生物在制备抗菌产品中的应用。
[0016]优选地，所述产品为药物、保健品、饲料、饲料添加剂、消毒剂、清洁剂或防腐剂。
[0017]所述抗菌产品为用于抑制、杀灭细菌的产品或用于预防或治疗细菌感染的产品。
[0018]所述抗菌产品可用于存在蛋白酶的环境。
[0019]本专利技术提供一种产品，其包含所述抗菌肽或其盐或所述肽纳米粒子或所述衍生物。
[0020]所述产品为药物、保健品、饲料、饲料添加剂、消毒剂、清洁剂或防腐剂。
[0021]本专利技术所述的药物还可包含药学领域允许的辅料。
[0022]本专利技术的有益效果至少在于：
[0023]本专利技术提供的抗菌肽具有广谱抗菌活性，同时具有较强的蛋白酶稳定性，该抗菌肽能够自组装形成肽纳米粒子，能够抵抗4mg/mL的糜蛋白酶和胰蛋白酶作用，可应用于蛋白酶存在的复杂生理环境中，对细菌感染性疾病发挥治疗作用，且该抗菌肽在高于MIC浓度下显示出较低的溶血活性，具备良好的临床应用价值。
附图说明
[0024]图1为本专利技术实施例1中合成的抗菌肽的高效液相色谱图，最高峰出峰时间为15.730分钟。
[0025]图2为本专利技术实施例1中合成的抗菌肽的质谱图。
[0026]图3为本专利技术实施例2中肽纳米粒子的透射电镜图像。
[0027]图4为本专利技术实施例5中肽纳米粒子的溶血活性检测结果图。
具体实施方式
[0028]以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。
[0029]以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0030]实施例1固相化学合成法合成抗菌肽
[0031]本实施例采用固相化学合成法合成抗菌肽，该抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，肽的液相图和质谱图如图1和图2所示，具体方法如下：
[0032]1、抗菌肽的制备从C端到N端逐一进行，通过多肽合成仪来完成。首先将Fmoc
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X(X是每个抗菌肽的C端第一个氨基酸)接入到Wang树脂，然后脱去Fmoc基团后得到X
‑
Wang树脂；再将Fmoc
‑
Y
‑
Trt
‑
OH(9
‑
芴甲氧羧基
‑
三甲基
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Y脱去保护基，Y为每个抗菌肽C端第二个氨
基酸)；按照这个程序依次从C端合成到N端，再将棕榈酸连接到树脂
‑
多肽的N末端，直至合成完毕，得到脱去Fmoc基团的侧链保护的树脂；
[0033]2、在上述得到的肽树脂中，加入切割试剂，20℃避光下反应2h，过滤；沉淀TFA(三氟乙酸)洗涤，将洗液与上述滤液混合，旋转蒸发仪浓缩，再加入10倍左右体积的预冷无水乙醚，
‑
20℃沉淀3h，析出白色粉末物，以2500g离心10min，收集沉淀，再用无水乙醚洗涤沉淀，真空干燥，得到多肽，其中切割试剂由TFA、水和TIS(三异丙基氯硅烷)按照质量比95:2.5:2.5混合而成；
[0034]3、使用0.2mol/L硫酸钠(磷酸调节至pH 7.5)进行柱平衡30min，用90％乙腈水溶液溶解多肽，过滤，C18反相常压柱，采用梯度本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.抗菌肽，其特征在于，其具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。2.根据权利要求1所述的抗菌肽，其特征在于，所述抗菌肽的N末端含有棕榈酸修饰。3.根据权利要求1或2所述的抗菌肽，其特征在于，所述抗菌肽的C末端含有酰胺化修饰。4.一种肽纳米粒子，其特征在于，所述肽纳米粒子由权利要求1～3项所述的抗菌肽自组装形成。5.权利要求1～3项所述的抗菌肽或权利要求4所述的肽纳米粒子的衍生物，其特征在于，所述衍生物为将权利要求1～3项所述的抗菌肽或权利要求4所述的肽纳米粒子与载体...

【专利技术属性】
技术研发人员：马曦，谭鹏，唐琪，孙菲泽，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：