一种与噻虫胺免疫复合体特异性结合的多肽及其用途制造技术

本发明专利技术属于生物技术领域，涉及具有与噻虫胺免疫复合体特异性结合的多肽，包括所述多肽在噻虫胺检测中的应用。本发明专利技术采用噬菌体展示技术，用噻虫胺免疫复合体对噬菌体展示随机十肽库进行淘选，筛选与噻虫胺免疫复合体特异性结合的噬菌体展示多肽；三轮淘选后，随机挑取若干噬菌体克隆进行扩增，通过噬菌体ELISA方法验证阳性噬菌体克隆，并将阳性克隆进行测序，获得多肽的氨基酸序列。本发明专利技术还涉及该噬菌体展示多肽在噻虫胺检测中的应用。用该噬菌体展示多肽建立的非竞争噬菌体酶联免疫分析方法可用于灵敏、准确、便捷、低成本的检测环境和农产品中噻虫胺残留。和农产品中噻虫胺残留。

【技术实现步骤摘要】
一种与噻虫胺免疫复合体特异性结合的多肽及其用途


[0001]本专利技术属于生物
，涉及具有与噻虫胺免疫复合体特异性结合的多肽，包括所述多肽在噻虫胺检测中的应用。

技术介绍

[0002]噻虫胺(Clothianidin)是由德国拜耳公司与日本住友公司联合开发的一种新烟碱类杀虫剂，具有防治范围广，杀虫活性高，内吸性好等优点，对飞虱、蚜虫、线虫、植食性螨等多种重要的经济作物害虫均具有良好的防治效果，是市场上销售量最好的杀虫剂之一。研究表明，噻虫胺对哺乳动物、鸟类、水生生物均存在慢性毒性，对非靶标昆虫尤其是蜜蜂高毒，已于2018年被欧盟各国禁止在户外使用。因此，快速、准确的检测农产品和环境样品中噻虫胺残留量，对保障农产品质量安全、生态环境安全和农产品进出口具有重要意义。
[0003]目前，噻虫胺的分析方法主要包括仪器分析方法和免疫分析方法。免疫分析以抗体
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抗原的特异性反应为基础，对待测物进行定性、定量检测，前处理简便，适用于高通量及现场检测。免疫分析可分为竞争模式和非竞争模式。大分子物质能够结合多个抗体，可用一种抗体将其固定于固相载体上，通过另一种抗体进行检测，通常使用非竞争模式。在这种模式中，分析物浓度与信号强度正相关，信号产生方式比较直观。农药等小分子化合物分子量较小，由于空间位阻的原因，只能结合一个抗体，为单抗原决定簇分析物，因此常通过竞争模式进行检测。在竞争模式中，分析物浓度与信号强度负相关，信号产生模式不直观，实际检测时易产生误判。研究表明，与竞争分析相比，非竞争免疫分析具有更好的灵敏度和特异性，且更适用于现场快速检测。
[0004]噬菌体展示技术由Smith于1985年专利技术，原理是在不影响噬菌体正常功能的情况下，通过分子克隆技术，将外源蛋白基因插入于丝状噬菌体外壳蛋白基因，从而使外源蛋白在丝状噬菌体外壳蛋白上表达。自从第一次报道至今，作为一种强大的工具，噬菌体展示技术被广泛应用于抗体、酶、配体、小分子受体的筛选。利用噬菌体展示技术，筛选能够识别农药
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抗体所形成的免疫复合体的多肽，可实现小分子化合物的非竞争免疫分析。虽然非竞争免疫分析在灵敏度、特异性等方面均优于传统竞争免疫分析，但抗免疫复合体筛选成功率低的现在限制了其广泛的应用。目前，国内外还没有能够与噻虫胺免疫复合体结合的多肽及其应用的相关研究和报道。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供与噻虫胺免疫复合体特异性结合的多肽，及相关多肽在噻虫胺检测中的应用。
[0006]本专利技术的目的通过下述技术方案予以实现：
[0007](1)将Protein A纯化的噻虫胺单克隆抗体包被于酶标板上，用5％脱脂奶粉将酶标板封闭后，加入噻虫胺，形成免疫复合体；随后，将噬菌体展示随机环状十肽库加入酶标板中进行淘选。淘选按照“吸附
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洗涤
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洗脱
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扩增”的流程进行，共进行3轮淘选，每轮淘选中
逐渐提高洗涤所用缓冲液的浓度，降低包被的噻虫胺单克隆抗体的浓度和噬菌体的投入量；
[0008](2)3轮淘选后，挑选32个噬菌体克隆，通过Phage
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ELISA验证能够识别免疫复合体的噬菌体展示多肽，提取其DNA进行测序，共发现2种多肽，其氨基酸序列分别为：SEQ ID NO 1：Cys Ala Val Phe Thr Asp Gln Trp Trp Thr Gly Cys；SEQ ID NO 2：Cys Ser Pro Glu Ser His Trp Pro Gln Val Leu Cys。所述多肽均由12个氨基酸组成，包含一个环状区域。该环状区域由多肽两端半胱氨酸残基二硫化形成。
[0009]本专利技术所述的多肽可与噻虫胺单克隆抗体组合，建立非竞争免疫分析方法，用于环境样品与农产品中的噻虫胺残留的检测。
[0010]本专利技术具有以下有益效果：(1)新颖：与噻虫胺免疫复合体特异性结合的多肽为国内外首次报道；(2)实用：利用本专利技术提供的噬菌体展示多肽，可以建立前处理简便、信号产生模式直观的噻虫胺非竞争免疫分析方法；(3)特异性强：本专利技术提供的噻虫胺抗免疫复合体多肽与噻虫胺结构类似物的交叉反应均小于0.1％；(4)灵敏度高：利用本专利技术提供的多肽实现的噻虫胺非竞争免疫分析方法的饱和信号中浓度(SC
50
)为0.45ng/mL，检测限(SC
10
，LOD)为0.26ng/mL；(5)准确度高：利用本专利技术提供的多肽实现的噻虫胺非竞争免疫分析方法在农产品中的添加回收率为76.6％
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102.2％，相对标准偏差为2.9％
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10.7％，符合残留分析标准。
附图说明
[0011]图1是挑选32个噬菌体克隆，通过phage
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ELISA验证阳性克隆的结果；横坐标为噬菌体克隆的编号，纵坐标为450nm处吸光值；
[0012]图2是所建立非竞争phage
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ELISA用于噻虫胺检测的标准曲线；横坐标为噻虫胺的浓度，单位为ng/mL；纵坐标为450nm处吸光值。
具体实施方式
[0013]本专利技术实施例中所用实验材料、主要试剂及配方如下：
[0014]主要实验材料：
[0015]Protein A纯化的噻虫胺单克隆抗体、噬菌体展示随机环状十肽库、ER 2738大肠杆菌由南京农业大学，植物保护学院，农药残留与环境毒理实验室制备、保存。
[0016]主要试剂：
[0017]Tween
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20(北京索莱宝科技有限公司)、脱脂奶粉(美国Bio
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Rad公司)、噻虫胺标准品(德国Dr.Ehrenstorfer公司)、三羟甲基氨基甲烷(北京索莱宝科技有限公司)、HRP(辣根过氧化物酶)
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抗噬菌体单克隆抗体(北京义翘神州生物有限公司)、四甲基联苯胺(美国Sigma公司)、牛血清白蛋白(美国Sigma公司)、甘氨酸(北京索莱宝科技有限公司)、胰蛋白胨(美国Thermo Fisher公司)、酵母提取物(美国Thermo Fisher公司)、D
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(+)
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葡萄糖(美国Sigma公司)、异丙基
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β
‑
D
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硫代半乳糖苷(美国Sigma公司)、氨苄盐酸盐(美国Sigma公司)、卡那霉素(美国Sigma公司)、四环素(美国Sigma公司)
[0018]主要试剂配方：
[0019]1、LB培养基：每升含10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，5g NaCl。高压灭菌，室温贮存；
[0020]2、SB培养基：每升含32g胰蛋白胨，20g酵母提取物，5g NaCl。高压灭菌，室温贮存；
[0021]3、四环素贮液(Tet)：以20mg/mL的浓度溶于50％乙醇中，
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20℃避光贮存；
[0022]4、氨苄贮存液(A本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.具有与噻虫胺免疫复合体特异性结合的多肽，其特征在于，所述多肽具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列。2.根据权利要求1所述具有与噻虫胺免疫复合体特异性结合的多肽，其特征在于，两端的半胱氨酸残基之间形成二硫键而被...

【专利技术属性】
技术研发人员：华修德，王鸣华，尤天阳，丁园，施海燕，周亮亮，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：