甲萘醌作为制备治疗肠癌肿瘤药物中的应用制造技术

本发明专利技术提供了一种甲萘醌作为制备治疗肠癌肿瘤药物中的应用，将坏死通路敏感细胞系L929

【技术实现步骤摘要】
甲萘醌作为制备治疗肠癌肿瘤药物中的应用


[0001]本专利技术属于细胞学药理学
，具体涉及一种涉及甲萘醌(Menadione，简称MENA)诱导肿瘤细胞发生程序性死亡的新型药物，即通过激活MAPK8表达促进肿瘤细胞程序性坏死的新药物，还涉及MENA用于治疗肠癌的新型药物的筛选方法。

技术介绍

[0002]尽管医疗水平不断提升，但肿瘤的治疗仍然面临着极大挑战，由于无法彻底杀死肿瘤细胞，不少肿瘤患者会出现预后差和复发等现象，因此寻找能够有效诱导肿瘤细胞发生死亡模式的药物已经成为了医学研究的重中之重。肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)是一类能使多种肿瘤发生出血性坏死的细胞因子，根据分泌TNF的细胞，可将TNF分为两类：巨噬细胞分泌的TNF
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α和T淋巴细胞分泌的TNF
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β，目前常说的TNF多指TNF
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α。由于其强大的抗肿瘤特性，TNF在1984年被应用于临床试验，是第一个被用于肿瘤生物疗法的细胞因子。TNF能激活细胞的一系列程序性死亡通路包括凋亡和程序性坏死，但当大量的TNF进入机体循环系统时，其药物副作用极大，例如会诱导产生类似脓毒血症的症状，甚至引起中毒性休克，最终导致多器官衰竭和死亡。TNF严重的毒副反应使得其在临床上的应用受到了极大的限制，目前仅应用于少数疾病的局部治疗，如TNF与IFN
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γ和melphalan联合治疗四肢黑色素瘤和软组织肉瘤。因此，考虑到TNF应用的局限性，应当寻找一些可替代TNF、诱导细胞发生程序性死亡的化合物。
[0003]然而新药研发是一个漫长的过程，需要耗费巨大的人力和物力资源，目前关于药物筛选平台和新药筛选背景，主要存在的问题是：一是在新药和治疗性生物制品的开发创新方面研发时间长，投资风险大；二是研发的药物溶解性和安全性亟需动物及临床验证。为了节约医药资源，“老药新用”成为了开发“新药”的另一策略。例如，利用已有的药物化合物库，通过细胞的生理生化基础，选择适当的筛选模型筛选样品，发现作用优良并具有特点的药物。在上述“老药新用”的研究过程中，最重要的发现药物新功能的重要技术手段是构建高通量药物筛选平台。该技术手段包括：采用已知药理特性的化合物进行筛选，而且筛选规模越大，发现“老药新用”的机会越多；基于细胞生理生化特性构建细胞模型的筛选，特别适用于功能蛋白难以分离、生化分析不能完成的复杂靶标(这些靶标可能涉及受体或细胞因子间复杂的相互作用)或多靶标。根据作用形式的不同，细胞模型可以分为作用于靶标(位于单一细胞位置，细胞膜上或细胞内)的筛选和作用于细胞整体功能、活性的筛选；其中前者作用位点和机制清楚，但必须明确靶标的生理功能及相应检测方法，后者能直接反映药物对细胞的整体反应，包括细胞毒性、细胞增殖特性、生长和死亡情况等。
[0004]同时，对于诱导肿瘤程序性坏死的现有药物的研究及应用，目前主要存在以下几个不足之处，包括：(1)以TNF
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α为代表的化合物，虽然容易穿过血脑屏障，是良好的分子机制研究工具，但因其化合物家族难溶于水或者电解质溶液，难以作为临床药物进行新药研发工作；(2)TNF
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α缺少靶向性以及较强的细胞毒性，在全身给药的情况下会伴随发热、寒战、恶心、呕吐、心动过速等不良反应；(3)已有新药筛选平台大多是基于未知天然产物或化
合物的筛选，其投入成本高，筛选周期和验证实验所需时间长；(4)基于未知化合物筛选出的药物，其对于人体的靶向性不明确，缺乏细胞毒性、细胞代谢和药物毒理学、药物动力学的数据；(5)目前已有的筛选平台基于普通细胞系或动物，筛选平台所用的模式细胞不利于判断药物对于程序性坏死的敏感度测试。

技术实现思路

[0005]针对现有技术中的不足，新药研发是一个漫长的过程，具有投入时间长，实验风险大等缺陷，为了节约医药资源，降低成本和风险提高成功率，充分开发现有药物的新用途，“老药新用”的研究层出不穷。因此本专利技术的目的是提供MENA作为制备治疗肠癌肿瘤药物中的应用。
[0006]基于坏死通路敏感细胞系L929
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FADD基因敲除株，对FDA批准药库内的化合物进行坏死抑制功能的研究，即基于FDA批准药物库，利用坏死敏感细胞系建立高通量筛选平台，既加快了药物动力学和毒理学的实验过程，又能靶向性地在程序性死亡的生理生化通路上进行筛选，发现筛选的MENA调控肠癌细胞凋亡和坏死的新化合物的靶点MAPK8。
[0007]为达到上述目的，本专利技术的解决方案是：
[0008]目的之一，本专利技术提供了MENA作为制备治疗肠癌肿瘤药物中的应用。
[0009]作为优选的实施例，MENA促进肿瘤细胞发生程序性死亡。
[0010]作为优选的实施例，程序性死亡肿瘤细胞发生凋亡和坏死细胞机制来实现。
[0011]作为优选的实施例，MENA靶向MAPK8诱导细胞发生坏死和凋亡。
[0012]目的之二，本专利技术提供了MENA作为制备治疗肠癌肿瘤药物的筛选方法，其包括以下步骤：
[0013](1)、坏死通路敏感细胞系L929
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FADD基因敲除细胞株复苏、培养与冻存；
[0014](2)、TargetMol公司供应的FDA批准的药物库的若干小分子化合物定量，且以肿瘤坏死因子TNF
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α及其相关复合物作为阳性对照药物；
[0015](3)、构建用于制备治疗肿瘤的药物筛选的细胞模型肠癌细胞HT
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29；
[0016](4)、检测步骤(3)中细胞模型的细胞存活率，并筛选候选药物为MENA；
[0017](5)、蛋白免疫沉淀检验步骤(4)中候选药物在程序性死亡MAPK8信号通路的表达。
[0018]作为优选的实施例，步骤(1)和步骤(3)的具体方法为：在液氮中取出冻存的L929
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FADD
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KO细胞和HT
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29细胞，迅速置于37℃水浴，不断晃动融解细胞，然后将L929
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FADD
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KO细胞和HT
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29细胞分别转入培养皿中加入培养基进行过夜培养，细胞贴壁后换液继续培养，待细胞生长至90％密度时传代。
[0019]其中，HT
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29细胞的培养基为含10％体积分数胎牛血清(FBS)的高糖DMEM培养基，在5％体积分数CO2、37℃和饱和湿度条件下培养。
[0020]L929
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FADD
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KO细胞的培养基为含10％体积分数胎牛血清(FBS)的高糖DMEM培养基且加入0.05μL/mL pruo和0.33μL/mL Nec
‑
1，在5％体积分数CO2、37℃和饱和湿度条件下培养。
[0021]再选生长状态好、生长旺盛的HT
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29细胞和L929
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FADD
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.甲萘醌作为制备治疗肠癌肿瘤药物中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述甲萘醌促进肿瘤细胞发生程序性死亡。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述程序性死亡肿瘤细胞发生凋亡和坏死细胞机制来实现。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述甲萘醌靶向MAPK8诱导细胞发生坏死和凋亡。5.根据权利要求1
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4任一项所述甲萘醌作为制备治疗肠癌肿瘤药物的筛选方法，其特征在于：其包括以下步骤：(1)、坏死通路敏感细胞系L929
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FADD基因敲除细胞株复苏、培养与冻存；(2)、FDA药物库的若干小分子化合物定量，且以肿瘤坏死因子TNF
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α及其复合物作为阳性对照药物；(3)、构建用于制备治疗肿瘤的药物筛选的细胞模型肠癌细胞HT
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29；(4)、检测步骤(3)中所述细胞模型的细胞存活率，并筛选候选药物为甲萘醌；(5)、蛋白免疫沉淀检验步骤(4)中所述候选药物在程序性死亡MAPK8信号通路的表达。6.根据权利要求5所述的筛选方法，其特征在于：步骤(1)和步骤(3)的具体方法为：在液氮中取出冻存的L929
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FADD
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KO细胞和HT
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29细胞，迅速置于37℃水浴，不断晃动融解细胞，然后将所述L929
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FADD
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KO细胞和HT
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29细胞分别转入培养皿中加入培养基进行过夜培养，细胞贴壁后换液继续培养，待细胞生长至90％密度时传代；其中，所述HT
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29细胞的培养基为含10％体积分数胎牛血清的高糖DMEM培养基，在5％体积分数CO2、37℃和饱和湿度条件下培养；所述L929
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FADD
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KO细胞的培养基为含10％体积分数胎牛血清的高糖DMEM培养基且加入0.05μL/mL pruo和0.33μL/mL Nec
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1，在5％体积分数CO2、37℃和饱和湿度条件下培养；再选生长状态好、生长旺盛的HT
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29细胞和L929
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FADD
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KO细胞用PBS洗两次后，用胰酶消化至细胞变圆，用RPMI
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1640培养基终止反应，800rpm离心5min后弃上清，加入冻存液，将细胞分装在冻存管中，放入程序降温盒中保存于
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80℃超低温冰箱中，24h后转移至液氮中；其中，所述RPMI
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1640培养基内含10％体积分数胎牛血清、1％体积分数青霉素和链霉素，终止反应条件为：95％体积分数空气、5％体积分数二氧化碳、37℃；所述冻存液的成分为：10％体积分数二甲基亚砜和90％体积分数小牛血清。7.根据权利要求5所述的筛选方法，其特征在于：步骤(2)中，所述复合物包括TNF

【专利技术属性】
技术研发人员：王慧，牟为，巴乾，
申请(专利权)人：上海交通大学医学院，
类型：发明
国别省市：