外周血单个核细胞的培养液及培养方法技术

本发明专利技术公开了一种外周血单个核细胞(PBMC)培养液及培养方法。本发明专利技术的培养液包括：体积比为1：0.9

【技术实现步骤摘要】
外周血单个核细胞的培养液及培养方法


[0001]本专利技术属于细胞培养
，更具体为PBMC培养液及培养方法。

技术介绍

[0002]诱导多能干细胞(Induced Pluripotent Stem Cells,iPSCs)是利用重编程技术获得的与胚胎干细胞功能类似的细胞。它具有分化为三胚层在内的所有细胞类型的潜能，是目前干细胞与组织再生研究领域的一项重大突破，因其解决了胚胎干细胞来源有限和伦理学障碍的难题，在医学领域展示了广阔的应用前景。目前，人iPSC细胞主要自皮肤成纤维细胞重编程而来，而从皮肤中取样面临着组织活检时间长，取材不方便，患者疼痛感强且有被细菌感染等风险，获取的细胞需要体外扩增到足量的成纤维细胞才能进行iPSC诱导，耗时较长。2010年，科学家从外周血细胞中诱导出iPSC，这项技术的出现为iPSC研究领域带来一次质的飞跃。相对于皮肤成纤维细胞，外周血取材方便，来源丰富，是一种理想的iPSC供体细胞，具有广泛的应用前景。
[0003]外周血单个核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell,PBMC)，指外周血中具有单个核的细胞，包括淋巴细胞、单核细胞、树突状细胞和其它少量祖细胞(如造血干细胞等)。目前最常用分离外周血单个核细胞的方法为Ficoll密度梯度离心法，该方法得到的细胞纯度较好，红细胞比例少。外周血中分离出来的单个核细胞一般在体外采用FBS或含有动物来源的组份(如BSA)进行培养，此类PBMC培养液扩增培养的效率较差，细胞活性不高，且不利于临床应用。r/>[0004]因此，要使PBMC重编程为人诱导性多能干细胞得到广泛应用，必须开发一种无血清、无动物源成份的PBMC培养液，其能够快速高效地扩增PBMC，同时具有较高的重编程效率。

技术实现思路

[0005]本专利技术提供外周血单个核细胞(PBMC)培养液以及培养方法，可以在较好地维持PBMC细胞的群体特性的同时大大提高PBMC细胞培养和诱导干细胞重编程效率。
[0006]本专利技术一方面提供外周血单个核细胞(PBMC)培养液，所述培养液包括：基础培养基DMEM/F12和血细胞培养基StemPro
‑
34，以及细胞生长因子、L
‑
抗坏血酸、β
‑
疏基乙醇、亚硝酸钠、乙醇胺、ROCK抑制剂、人血清白蛋白、转铁蛋白、肝素钠和AHR抑制剂。
[0007]在一些实施方案中，所述ROCK抑制剂为Thiazovivin、Y
‑
27632或KD
‑
025；更优选地，所述ROCK抑制剂的浓度为1
‑
10μM/mL，更优选为5μM/mL。
[0008]在一些实施方案中，所述AHR抑制剂为SR1、PD98059、CH
‑
223191、AHR antagonist 2、AHR antagonist 4、GNF351或PDM2；更优选地，所述AHR抑制剂浓度为0.5
‑
5μM/mL，更优选为2μM/mL。
[0009]在一些实施方案中，所述培养液进一步包括去乙酰化酶抑制剂。
[0010]在一些实施方案中，所述去乙酰化酶抑制剂为VPA、NaBu、TSA或SAHA；更优选地，所
述去乙酰化酶抑制剂浓度为0.5
‑
5μM/mL，更优选为2μM/mL。
[0011]在一些实施方案中，所述培养液进一步包括GSK
‑
3抑制剂。
[0012]在一些实施方案中，所述GSK
‑
3抑制剂为CHIR99021、SB 216763、TWS119、LY2090314、Tideglusib或小分子化合物BIO；更优选地，所述GSK
‑
3抑制剂浓度为0.1
‑
1μM/mL，更优选为0.5μM/mL。
[0013]在一些实施方案中，所述培养液中包含的细胞生长因子包括所述的细胞生长因子包括SCF、IGF
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1、FLT
‑
3L、TPO、EPO和GM
‑
CSF。
[0014]在一些实施方案中，所述培养液中生长因子SCF的浓度为10
‑
100ng/mL，优选为10
‑
50ng/mL，更优选为25ng/mL。
[0015]在一些实施方案中，所述培养液中生长因子IGF
‑
1的浓度为10
‑
100ng/mL，优选为10
‑
50ng/mL，更优选为25ng/mL。
[0016]在一些实施方案中，所述培养液中生长因子FLT
‑
3L的浓度为10
‑
100ng/mL，优选为10
‑
50ng/mL，更优选为20ng/mL。
[0017]在一些实施方案中，所述培养液中生长因子TPO的浓度为10
‑
100ng/mL，优选为10
‑
50ng/mL，更优选为25ng/mL。
[0018]在一些实施方案中，所述培养液中生长因子EPO的浓度为10
‑
100ng/mL，优选为10
‑
50ng/mL，更优选为30ng/mL。
[0019]在一些实施方案中，所述培养液中生长因子GM
‑
CSF的浓度为10
‑
100ng/mL，优选为10
‑
50ng/mL，更优选为25ng/mL。
[0020]在一些实施方案中，所述培养液中L
‑
抗坏血酸浓度为100μM
‑
1mM/mL，优选为500μM/mL。
[0021]在一些实施方案中，所述培养液中β
‑
疏基乙醇浓度为1
‑
10μM/mL，优选为5μM/mL。
[0022]在一些实施方案中，所述培养液中亚硝酸钠浓度为1
‑
10μM/mL，优选为5μM/mL。
[0023]在一些实施方案中，所述培养液中乙醇胺浓度为1
‑
10μM/mL，优选为5μM/mL。
[0024]在一些实施方案中，所述培养液中人血清白蛋白浓度为5
‑
50g/L，优选为10g/L。
[0025]在一些实施方案中，所述培养液中转铁蛋白浓度为50
‑
500μg/mL，优选为75μg/mL。
[0026]在一些实施方案中，所述培养液中肝素钠浓度为50
‑
500μg/mL，优选为250μg/mL。
[0027]在一些实施方案中，所述培养液中DMEM/F12培养基和血细胞培养基StemPro
‑
34的体积比为1：0.9
‑
1.3。
[0028]本专利技术的另一方面提供外周血单个核细胞(PBMC)的培养方法，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.外周血单个核细胞(PBMC)培养液，其特征在于，所述培养液包括：基础培养基DMEM/F12和血细胞培养基StemPro
‑
34，以及细胞生长因子、L
‑
抗坏血酸、β
‑
疏基乙醇、亚硝酸钠、乙醇胺、ROCK抑制剂、人血清白蛋白、转铁蛋白、肝素钠和AHR抑制剂；优选地，所述ROCK抑制剂为Thiazovivin、Y
‑
27632或KD
‑
025；更优选地，所述ROCK抑制剂的浓度为1
‑
10μM/mL，更优选为5μM/mL；优选地，所述AHR抑制剂为SR1、PD98059、CH
‑
223191、AHR antagonist 2、AHR antagonist 4、GNF351或PDM2；更优选地，所述AHR抑制剂浓度为0.5
‑
5μM/mL，更优选为2μM/mL。2.如权利要求1所述的外周血单个核细胞培养液，所述培养液还包括去乙酰化酶抑制剂；优选地，所述去乙酰化酶抑制剂为VPA、NaBu、TSA或SAHA；更优选地，所述去乙酰化酶抑制剂浓度为0.5
‑
5μM/mL，更优选为2μM/mL。3.如权利要求1或2所述的外周血单个核细胞培养液，所述培养液还包括GSK
‑
3抑制剂；优选地，所述GSK
‑
3抑制剂为CHIR99021、SB 216763、TWS119、LY2090314、Tideglusib或小分子化合物BIO；更优选地，所述GSK
‑
3抑制剂浓度为0.1
‑
1μM/mL，更优选为0.5μM/mL。4.如权利要求1
‑
3任一项所述的外周血单个核细胞培养液，其中所述的细胞生长因子包括SCF、IGF
‑
1、FLT
‑
3L、TPO、EPO和GM
‑
CSF。5.如权利要求4所述的外周血单个核细胞培养液，其中生长因子SCF的浓度为10
‑
100ng/mL，IGF
‑
1的浓度为10
‑
100ng/mL，FLT
‑
3L的浓度为10
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100ng/mL，TPO的浓度为10
‑
100ng/mL，EPO的浓度为10
‑
100ng/mL，GM
‑
CSF的浓度为10
‑
100ng/mL。6.如权利要求1
‑
3所述的外周血单个核细胞培养液，其中所述的细胞因子SCF浓度为25ng/mL，IGF
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1浓度为25ng/mL，FLT
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3L浓度为2...

【专利技术属性】
技术研发人员：高歌，周安宇，
申请(专利权)人：上海爱萨尔生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：