一种基于表面修饰的功能化红细胞及其制备方法和在分离外泌体中的应用技术

本发明专利技术公开了一种基于表面修饰的功能化红细胞及其制备方法和在分离外泌体中的应用。其制备方法为：将anti

【技术实现步骤摘要】
一种基于表面修饰的功能化红细胞及其制备方法和在分离外泌体中的应用


[0001]本专利技术属于细胞工程
，具体涉及一种基于表面修饰的功能化红细胞制备方法和在分离外泌体中的应用。

技术介绍

[0002]细胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)是由机体多种细胞主动分泌的纳米级脂质双层膜囊泡，根据其合成、尺寸和生物学特性，胞外囊泡又可进一步分类为外泌体(exosomes)和微小囊泡(microvesicles)。其中，直径约为40～150nm的外泌体广泛存在并分布于血液及各种体液中；通过携带的信号分子，外泌体构成了机体内全新的细胞间信息通讯系统，不仅影响细胞的正常生理功能，而且参与多种疾病的发生发展。特别是肿瘤细胞来源的外泌体，其自身以及内含丰富且稳定的多种生物学物质(如：蛋白质、mRNA、miRNA和DNA等)。外泌体具有独特的生物学特性，为肿瘤的液体活检提供了非侵袭性的分子信息。但是现有的外泌体分离技术手段多需要特定的仪器设备(超速离心机)、分离纯度低(亲和吸附)、依赖制备过程复杂的抗体(外泌体分离磁珠)，这些方法难以满足临床对肿瘤来源外泌体研究的需求，极大地限制了其临床应用。因此，发展简单、快速和高效的外泌体离心分离和富集技术，已成为液体活检中实现外泌体检测亟待解决的首要问题。
[0003]红细胞是一种天然易得的生物材料，由于膜结构的脂质和表面丰富负电荷，在循环中的红细胞能够互相独立而不聚集在一起，呈现出较好的悬浮稳定性。红细胞具有良好的可塑变形性，在离心力等外力的作用下能产生形变从而减少机械力对其结构的破坏，在分离外泌体的过程中可充当“海绵垫”保护外泌体结构的完整。成熟的红细胞没有细胞核，不需要洗脱就可以随着外泌体一起裂解提取核酸，从而最大程度保存外泌体捕获数量，进而用于下游对外泌体来源DNA、miRNA等核酸分子的分析。而且红细胞膜上有丰富的糖蛋白、简单蛋白及膜收缩蛋白，这些蛋白有些突出在细胞表面，好像伸出在地面上的树枝，如ABH抗原；有些镶嵌在细胞膜内，如Rh抗原，这些丰富的红细胞膜蛋白使其具有大量的修饰位点，便于利用生物分子对红细胞进行功能化改造。
[0004]另一方面，传统的外泌体分离磁珠利用抗体捕获外泌体，但蛋白质作为探针分子易受pH、温度等环境因素影响而变性且合成价格昂贵，适配体由DNA或RNA构成(主要是DNA)，比蛋白质体积更小，经筛选富集后，可以拥有与抗原
‑
抗体反应相匹敌的灵敏度，同时合成更容易，稳定性更好。核酸适配体能与多种目标物质高特异性、高选择性地结合，基于功能化核酸代替抗体特异性识别靶物质也为该领域研究带来了新的动力。有研究已经利用对外泌体膜表面簇分化抗原CD63具有特异识别功能的适体(aptamer)成功的识别肿瘤外泌体。

技术实现思路

[0005]针对现有技术中的上述不足，本专利技术提供一种基于表面修饰的功能化红细胞及其
制备方法和在分离外泌体中的应用，本专利技术以天然生物材料红细胞为基础，构建了能够不借助超速离心、外泌体抗体和复杂提取试剂的外泌体分离体系和方法。
[0006]为实现上述目的，本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：
[0007]一种基于表面修饰的功能化红细胞的制备方法，将anti
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RBC与红细胞混合，于40～50℃反应1～2h后，再进行活化，活化结束后加入外泌体的特异性适配体进行修饰。
[0008]进一步地，特异性适配体为Apt
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CD63，适配体的具体序列如下：CACCCCACCTCGCTCCCGTGACACTAATGCTATTTTTTTTTT(SEQ ID NO.1)。
[0009]进一步地，适配体还可以是其余能够与外泌体特异性结合的适配体。
[0010]进一步地，包括以下步骤：
[0011](1)配制MES缓冲液
[0012](2)分离洗涤红细胞；
[0013](3)将红细胞与anti
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RBC以体积比为1:5～50的比例混合，于40～50℃反应1～2h，反应期间翻转反应容器5～6次；
[0014](4)将步骤(3)所得红细胞/anti
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RBC复合物、EDC、NHS、MES混合均匀，于室温静置活化15～20min，然后加入适配体，于4℃放置10～12h，期间每15min混匀一次；
[0015](5)于4℃，4000～5000rpm离心步骤(4)所得溶液，然后收集下层的功能化红细胞即可。
[0016]进一步地，步骤(4)中红细胞/anti
‑
RBC复合物、EDC、NHS以及适配体的体积比为15～20:1～2:1～2:1。
[0017]进一步地，EDC的浓度为5mM；NHS的浓度为12.5mM；适配体的浓度为100μM；红细胞/anti
‑
RBC复合物的浓度为5
×
10
12
/L。
[0018]上述方法制备得到的功能化红细胞。
[0019]采用上述功能化红细胞分离外泌体的方法，包括以下步骤：
[0020](1)将血浆用等体积的PBS稀释混匀；
[0021](2)将功能化红细胞与血浆混匀后，4℃，3000～4000rpm离心1～5min后收集固相产物；
[0022](3)用PBS将固相产物吹打混匀，然后加入核酸酶，于4℃，3000～4000rpm离心5～10min，收集离心液相即可获得外泌体。
[0023]一种用于进行外泌体分离的试剂盒，包括上述功能化红细胞。
[0024]本专利技术的设计原理如下：
[0025]结合天然生物材料红细胞和核酸适配体的优势，利用适配体功能化红细胞，实现对肿瘤细胞来源外泌体的高效富集和分离。首先通过抗红细胞的抗体特异性结合红细胞，抗体的多肽在红细胞表面提供了足够多羧基以作为修饰氨基的适体结合位点；通过氨基羧基的交联反应可将针对外泌体的特异性适体固定在红细胞表面，组成红细胞/抗体/适体的外泌体捕获平台。仅需要将功能化的红细胞与取自病人的体液标本混合，便可通过适体结合游离的外泌体，随后通过简单的离心可将附着在红细胞表面的外泌体一起分离达到外泌体的高效分离富集。外泌体的核酸提取可以直接使用裂解液分解红细胞外泌体结合物，而毋须担心来自红细胞的干扰；而如需得到完整的外泌体，则可以使用核酸酶水解适体链释放捕获的外泌体，此时红细胞随着离心沉积在管底，外泌体由于密度较小则存在于上清液
当中。
[0026]本专利技术的有益效果：
[0027]1、本专利技术构建的新型“适配体功能化红细胞”能简单、快速分离并富集外泌体。
[0028]2、本专利技术可以不需要洗脱、超速离心等复杂步骤，将分离的外泌体直接用于后续DNA、mRNA、miRNA等生物分子的分析，使外泌体的研究更加简便、快捷。
[0029]3、对于需要保持外泌体结构独立完整的研究，本专利技术也能达到最大程度保持所获得外泌体的完整和高纯度。本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于表面修饰的功能化红细胞的制备方法，其特征在于，将anti
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RBC与红细胞混合，于40～50℃反应1～2h后，再进行活化，活化结束后加入外泌体的特异性适配体进行修饰。2.根据权利要求1所述的基于表面修饰的功能化红细胞的制备方法，其特征在于，所述特异性适配体为Apt
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CD63，其核苷酸序列SEQ ID NO.1所示。3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)配制MES缓冲液(2)分离洗涤红细胞；(3)将红细胞与anti
‑
RBC以体积比为1:5～50的比例混合，于40～50℃反应1～2h，反应期间翻转反应容器5～6次；(4)将步骤(3)所得红细胞/anti
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RBC复合物、EDC、NHS、MES混合均匀，于室温静置活化15～20min，然后加入特异性适配体，于4℃放置10～12h，期间每15min混匀一次；(5)于4℃，4000～5000rpm离心步骤(4)所得溶液，然后收集下层的功能化红细胞即可...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭斌，范云鹏，谢宁，王强，郭晓兰，
申请(专利权)人：重庆市中医院，
类型：发明
国别省市：