一种体外活化免疫细胞的方法技术

本发明专利技术关于一种体外活化免疫细胞的方法，该方法是以含有Muparfostat的培养基进行外周血单个核细胞的培养，有效抑制自然杀伤细胞及T细胞于细胞表面表达LAG-3，藉由阻断细胞抑制性讯号的传递，增强自然杀伤细胞及T细胞的活性。性。性。

【技术实现步骤摘要】
一种体外活化免疫细胞的方法


[0001]本专利技术是关于一种体外活化免疫细胞的方法。

技术介绍

[0002]免疫细胞治疗是将病人本身的免疫细胞在体外增殖和活化后，再回输至体内的一种治疗方式。目前免疫细胞治疗已逐渐被应用于癌症治疗上，成功的关键在于了解各类免疫细胞的特性和功能，并根据癌症患者的状况及基因特性来选择最合适的免疫细胞类型，例如自然杀伤细胞(NK细胞)、T细胞等。
[0003]免疫细胞存在于外周血液。自血液分离出的外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)中，存在数种类型的细胞，包含血球细胞、淋巴球细胞及血小板。其中，淋巴球细胞即包含NK细胞、T细胞、NKT细胞、B细胞等免疫细胞。
[0004]由于NK细胞及T细胞的活性是受到活化或抑制性受体的调控。其中，表达于NK细胞及T细胞表面的LAG-3，属于抑制性的受体，亦称为免疫检查点。当LAG-3与其配体结合时，将对NK细胞或T细胞传导抑制性的讯息，进而抑制NK细胞或T细胞的活性。因此以NK细胞及T细胞进行细胞疗法的挑战在于是否能够使该细胞持续被活化，不被抑制性受体的讯息所抑制。近几年发现，使用抗LAG-3抗体能够阻断LAG-3所传导的抑制性讯息，促进NK细胞或T细胞活化。然而，抗LAG-3抗体用于培养细胞仅提供暂时性的阻断效果，不但成本高且LAG-3抗体尚于试验阶段，注射至人体内仍存在一定疑虑，因此仍极需要开发出一种方便、有效、安全的体外活化免疫作用细胞的方法。
[0005]Muparfostat，又称为PI-88，是天然酵母菌发酵产物经磺化所得的磺酸化单磷酸甘露寡聚糖，已知为乙酰肝素酶抑制剂(heparinaseinhibitor)，具有抑制血管新生及抑制癌细胞转移的效果。Muparfostat应用于体外免疫细胞培养方法与效用，目前未有相关研究。

技术实现思路

[0006]本专利技术于一方面，提供一种体外活化免疫细胞的方法，其包含以下步骤：自一血液检体分离出外周血单个核细胞；自该外周血单个核细胞悬浮于一含有Muparfostat的培养基并置于一细胞培养盘中；每日于该培养基添加Muparfostat，培养4至18天。
[0007]在一具体实施例中，前述Muparfostat每日于培养基添加的量是300μg/ml；在一较佳实施例中，前述培养基另包含基础培养基及细胞激素。在另一较佳实施例中，该细胞激素是白介素2；其中该白介素2于该培养基的浓度是介于500至1000IU/ml。
[0008]在一具体实施例中，前述免疫细胞包含自然杀伤细胞及T细胞。
[0009]本专利技术于另一方面，提供一种体外抑制免疫细胞表达LAG-3的方法，其包含以下步骤：自一血液检体分离出外周血单个核细胞；自该外周血单个核细胞悬浮于一含有Muparfostat的培养基并置于一细胞培养盘中；每日于该培养基添加Muparfostat，培养4至18天。
[0010]前面的概述，以及本专利技术以下的详细描述，在结合图式一起阅读时将可以被更好地理解。为了说明本专利技术，所附图式示出一些，但不是所有的，可替代的具体实施例。然而，应该理解的是，本专利技术并不限于所示的精确安排和手段。这些图式，其被并入并构成说明书的一部分，有助于解释本专利技术的原理。
附图说明
[0011]图1是本专利技术的免疫细胞体外活化方法流程图。
[0012]图2是依本专利技术培养PBMC后，针对表达LAG-3的自然杀伤细胞进行数量分析。
[0013]图3是依本专利技术培养PBMC后，针对细胞中LAG3蛋白质的表达量进行分析。
[0014]图4是依本专利技术培养PBMC并将其与一癌细胞株共同培养后，针对表达LAG-3的T细胞进行数量分析。其中，图4A为PBMC与A549癌细胞株共同培养的分析结果；而图4B为PBMC与HepG2癌细胞株共同培养的分析结果。
[0015]图5是依本专利技术培养PBMC并将其与一癌细胞株共同培养后，针对表达LAG-3的自然杀伤细胞(NK细胞)进行数量分析。其中，图5A为PBMC与A549癌细胞株共同培养的分析结果；而图5B为PBMC与HepG2癌细胞株共同培养的分析结果。
具体实施方式
[0016]有鉴于上述待解决的问题，本专利技术提出一种体外活化免疫细胞的方法，该方法是以含有Muparfostat的培养基进行外周血单个核细胞的培养，有效抑制自然杀伤细胞及T细胞于细胞表面表达LAG-3，藉由阻断细胞抑制性讯号的传递，增强自然杀伤细胞及T细胞的活性。
[0017]定义
[0018]除非另有定义，所有在此使用的技术及科学术语，具有与本领域普通技术人员一般所理解的意义相同的意义。当有所冲突时，以本文件及其所定义者为准。
[0019]于此处所使用者，「约」、「大约」、或「大概」一般应指一特定数值或范围的20％以内，较佳10％以内，及更佳5％以内。在此所使用的数值为近似值，代表若未明示地陈述，「约」、「大约」、或「大概」等词可以被推断适用。
[0020]于本专利技术中，「自然杀伤细胞」(natural killer cell)或「NK细胞」是指细胞表面抗原呈现CD3-CD56
+
的细胞。
[0021]于本专利技术中，「T细胞」(T cell)是指细胞表面抗原呈现CD3
+
的细胞。
[0022]于本专利技术中，「免疫细胞」是指外周血单个核细胞中的淋巴球细胞。
[0023]于本专利技术中，免疫细胞被「活化」是以下列方式判断：当NK细胞或T细胞不表达LAG-3时，该NK细胞或该T细胞具有较佳的活性。
[0024]材料与方法
[0025]本专利技术所述外周血检体，是依据伦理委员会通过的计划，自受试者手臂采集全血，置于无菌采血管，于室温存放待后续处理。
[0026]本专利技术所使用的基础培养基可选用自：CellGro SCGM(CellGenix公司)、KBM 501(Kohjin Bio公司)、AIM-V(Thermo Fisher公司)、X-VIV015(Lonza公司)、DMEM或RPM1-1640等市售的基础培养基。
[0027]本专利技术所述培养基中，有时含有适当的蛋白质、细胞激素、抗体、血清、化合物等成分。所述细胞激素有时为白介素-2(IL-2)、白介素-3(IL-3)、白介素-7(IL-7)、白介素-12(IL-12)、白介素-15(IL-15)、白介素-18(IL-18)或白介素-21(IL-21)。
[0028]制备muparfostat(PI-88)及包含其中的硫化磷酸甘露聚醣成份的方法已被美国专利公开号20140135282以及P.N.Handley等人所揭示(2017年)。P.N.Handley等人发表于醣类研究446-447第68至75页的「对酵母菌Pichia(Hansenula)holstii NRRL Y2448磷酸甘露聚醣的寡糖磷酸盐级分的新结构洞悉」一文中，揭示了PI-88的硫化磷酸甘露聚本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种体外活化免疫细胞的方法，其包含以下步骤：(a)自一血液检体分离出外周血单个核细胞；(c)将该外周血单个核细胞悬浮于一含有Muparfostat的培养基并置于一细胞培养盘中培养；以及(d)每日于该培养基添加Muparfostat，培养4至18天。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，其中该Muparfostat每日于培养基添加的量是300μg/ml。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，其中该培养基另包含基础培养基以及细胞激素。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，其中该细胞激素是白介素2；其中该且白介素2于该培养基的浓度是介于500至1000IU/ml。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，其中该免疫细胞包含自然杀伤细胞及T细胞。6.一种体外抑...

【专利技术属性】
技术研发人员：张顺浪，林杰良，孙境新，刘威廷，唐晓艳，
申请(专利权)人：基亚细胞科技有限公司，
类型：发明
国别省市：