黄瓜内源启动子及其应用制造技术

本发明专利技术涉及植物生物技术领域，具体涉及一种黄瓜内源启动子及应用。本发明专利技术要解决的是提供一种黄瓜内源高活性启动元件。本发明专利技术提供了一种DNA分子，命名为CsCRE02。本发明专利技术启动子CsCRE02不仅可高效稳定地在黄瓜中驱动基因表达，还可以在水稻等其他植物种高效稳定地驱动基因表达，为使用转基因技术或基因组编辑技术等现代生物学技术进行黄瓜遗传定向改良提供了一个好的工具，在黄瓜的生物学研究中具有极大的价值。大的价值。大的价值。

【技术实现步骤摘要】
黄瓜内源启动子及其应用


[0001]本专利技术涉及植物生物
，具体涉及一种黄瓜内源启动子及其应用。

技术介绍

[0002]黄瓜(Cucumis sativus)为葫芦科(Cucurbitaceae)黄瓜属(Cucumis)植物，广泛分布于世界各地，是主要的蔬菜品种，也是重要的双子叶植物基因组结构及功能研究模式材料。但由于黄瓜本身具有的遗传基础狭窄及育种年限较长的特点，使得常规遗传操作技术在黄瓜中难以取得突破性的进展，极大影响了黄瓜功能基因组基础研究及分子育种实践。
[0003]随着转基因及基因组编辑等基因组工程技术快速发展，黄瓜功能基因组研究及种质创新实践迎来了新的机遇和挑战。转基因技术通过将人们预先设计好的外源DNA通过生物技术手段导入受体细胞并整合于受体基因组上，使外源基因得以在受体内稳定表达并且还具备代代遗传能力。基因组编辑技术则通过将人工序列特异性核酸酶导入受体细胞后在基因组选定位置切割或结合，进而实现特异基因的敲除或下游基因的表达调控。相较于传统的杂交育种，转基因技术及基因组编辑技术是实现黄瓜遗传性状的快速定向改良的有力工具。
[0004]启动子(Promoter)是调控下游基因转录表达的一类重要功能元件，是位于基因起始密码子(ATG)上游的一段DNA，能够与RNA聚合酶结合并启动基因的转录，相当于基因转录的“开关”。启动子是驱动目标基因在细胞中进行表达与翻译的关键因子，无论是何种基因工程技术，都需要应用启动子进行实现。在基因工程操作中，同时使用同一类型启动子驱动多个外源基因可能导致基因沉默或共抑制现象，因此需要不同的启动子元件，目前黄瓜基因工程中普遍使用的启动子主要为花椰菜花叶病毒CaMV35S启动子，可选择性较少，关于黄瓜内源高效启动子分离的研究工作仍相对较少，因此分离活性优良的黄瓜内源启动子对黄瓜功能基因研究和遗传育种改良具有重要意义。

技术实现思路

[0005]专利技术的目的是提供一种黄瓜内源高活性启动元件。本专利技术解决技术问题的技术方案是提供一种DNA分子。该DNA分子为如下a)或b)或c)所示：
[0006]a)、核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的DNA分子；
[0007]b)、与a)限定的核苷酸序列具有90％以上、95％以上、97％以上或者99％以上同源性，且具有启动子功能的DNA分子；
[0008]c)、与a)或b)限定的核苷酸序列能互补配对，且具有启动子功能的DNA分子。
[0009]进一步的，本专利技术提供了含有上述DNA分子的基因表达框或者含有上述DNA分子的重组质粒。
[0010]本专利技术也提供了含有上述DNA分子的重组微生物、转基因植物细胞系或转基因动物细胞系。
[0011]另一方面，本专利技术也提供了上述DNA分子作为启动子的应用。
[0012]同时，本专利技术也提供了上述的DNA分子、表达框或重组质粒在启动目的基因表达中的应用。
[0013]其中，上述应用种所述启动目标基因表达为在微生物、植物细胞或动物细胞中启动表达。
[0014]其中，上述应用中所述的植物为双子叶植物或单子叶植物。
[0015]进一步的，所述双子叶植物为葫芦科植物。优选的，所述葫芦科植物为黄瓜属植物。进一步的，所述的黄瓜属植物为黄瓜。
[0016]其中，上述应用中所述的单子叶植物为禾本科植物。其中，所述禾本科植物为稻属植物。进一步的，所述的稻属植物为水稻。
[0017]本专利技术也提供了表达目的基因的方法。该方法以上述DNA分子作为启动子来启动目的基因的表达。
[0018]其中，上述方法中是将上述DNA分子可操作地连接在待表达的目的基因的上游，启动目的基因的表达。
[0019]本专利技术从黄瓜中得到了一种具有启动子功能的核苷酸片段，命名为CsCRE02。通过实验证明启动子CsCRE02不仅可高效稳定地在黄瓜中驱动基因表达，还可以在水稻等其他植物种高效稳定地驱动基因表达。尤其是在黄瓜原生质体中，驱动基因转录的活性明显优于其他候选启动子元件，且明显优于目前植物基因组工程中常用的CaMV 35S及ZmUbi1启动子。同时，本专利技术也通过实验证明该启动子元件在还能在黄瓜基因组编辑上得到很好的效果。本专利技术为使用转基因技术或基因组编辑技术等现代生物学技术进行黄瓜遗传定向改良提供了一个好的工具，在黄瓜的生物学研究中具有很大的价值。
附图说明
[0020]图1、黄瓜启动子挖掘及表达检测实验中所用骨架载体与表达载体示意图。
[0021]图2、基于本专利技术中不同黄瓜候选启动子元件构建的荧光报告载体瞬时转化水稻原生质体，绿色荧光蛋白表达情况(物镜10
×
)。
[0022]图3、基于本专利技术中不同黄瓜候选启动子元件构建的荧光报告载体瞬时转化黄瓜原生质体，绿色荧光蛋白表达情况(物镜10
×
)。
[0023]图4、基于本专利技术中CsCRE02、CsCRE10、CsCRE11启动子元件构建的GFP
‑
GUS重组表达载体进行黄瓜毛状根转化，得到的黄瓜毛状根绿色荧光蛋白表达情况(比例尺＝1cm)。
[0024]图5、基于本专利技术中CsCRE02、CsCRE10、CsCRE11启动子元件构建的GFP
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GUS重组表达载体进行黄瓜毛状根转化，得到的黄瓜毛状根进行GUS组织化学染色的结果(比例尺＝1cm)。
[0025]图6、基于本专利技术中CsCRE02、CsCRE10启动子元件的黄瓜CsGA20ox1
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sgRNA01、 CsGA20ox3
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sgRNA01基因编辑表达载体进行黄瓜毛状根转化，提取毛状根基因组DNA，进行PCR
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RFLP及Sanger测序分析的结果。
[0026]图7、图2结果对应的相对荧光强度定量分析结果(水稻原生质体)。
[0027]图8、图3结果对应的相对荧光强度定量分析结果(黄瓜原生质体)。
具体实施方式
[0028]启动子是一类调控基因转录表达的重要功能元件，目前黄瓜基因工程中普遍使用的启动子主要为花椰菜花叶病毒CaMV35S启动子，可选择性较少。因此鉴定出黄瓜内源活性优良的启动子将为黄瓜基因功能研究和遗传育种改良等工作创造很大价值。但目前黄瓜内源启动子分离的研究报道极少，启动子挖掘工作造成困难。
[0029]本专利技术结合黄瓜RNA
‑
seq和ATAC
‑
seq数据，从黄瓜基因组中初步筛选了11个具有潜在转录活性的候选启动子元件。在11个候选启动子中发现有6个候选启动子在水稻原生质体中具有一定的转录功能活性，编号分别为CsCRE02、CsCRE04、CsCRE07、CsCRE09、CsCRE10、 CsCRE11。进一步的，在黄瓜原生质体中发现有4个CsCRE02、CsCRE04、CsCRE10、CsCRE11 有转录功能活性。其中，CsCRE02启动子的转录活性明显优于目前植物基因组工程本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.DNA分子，其特征在于所述DNA分子为如下a)或b)或c)：a)、核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的DNA分子；b)、与a)限定的核苷酸序列具有90％以上、95％以上、97％以上或者99％以上同源性，且具有启动子功能的DNA分子；c)、在严格条件下与a)或b)限定的核苷酸序列杂交，且具有启动子功能的DNA分子。2.含有权利要求1所述DNA分子的基因表达框或者含有权利要求1所述DNA分子的重组质粒。3.含有权利要求1所述DNA分子的重组微生物、转基因植物细胞系或转基因动物细胞系。4.含有权利要求1所述DNA分子的转基因植物株系或转基因植物品种。5.权利要求1所述DNA分子作为启动子的应用。6.权利要求1所述DNA分子、权利要求2所述表达框或权利要求3所述重...

【专利技术属性】
技术研发人员：张勇，唐旭，张韬，郑雪莲，周建平，
申请(专利权)人：电子科技大学，
类型：发明
国别省市：