细粒棘球绦虫原头节源和囊液源外泌体非编码RNA表达谱分析方法及非编码RNA序列技术

本发明专利技术公开了一种细粒棘球绦虫原头节源和囊液源外泌体非编码RNA表达谱分析方法，包括如下步骤：1)细粒棘球绦虫原头节和囊液分离；2)细粒棘球绦虫原头节体外培养；3)细粒棘球绦虫原头节和囊液源外泌体分离，获得原头节源外泌体PSC-ELVs和囊液源外泌体HF-ELVs；4)透射电镜分析；5)纳米粒径跟踪分析；6)Western blotting；7)miRNA文库构建及测序；8)全转录组测序文库构建及测序分析；9)ceRNA调控网络构建。此外，本发明专利技术还公开了采用该方法筛选获得的细粒棘球绦虫原头节源和囊液源外泌体非编码RNA。本发明专利技术为国际上首次获得细粒棘球蚴原头节源和囊液源外泌体中非编码RNA表达谱。头节源和囊液源外泌体中非编码RNA表达谱。头节源和囊液源外泌体中非编码RNA表达谱。

【技术实现步骤摘要】
细粒棘球绦虫原头节源和囊液源外泌体非编码RNA表达谱分析方法及非编码RNA序列


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及一种细粒棘球绦虫原头节源和囊液源外泌体非编码RNA表达谱分析方法。此外，本专利技术涉及细粒棘球绦虫原头节源和囊液源外泌体非编码RNA序列。

技术介绍

[0002]外泌体是一类直径30～150nm的囊泡样小体，可携带脂质、蛋白质和核酸等生物活性物质，在细胞间物质交换和信息传递中起重要作用。外泌体具有脂质分子层，使其携带的内容物在远距离运输过程中仍保持稳定，并通过膜融合的方式在细胞间传递蛋白质、脂质、DNA和RNA等功能组分，在疾病发展过程中发挥重要免疫调节作用。外泌体可通过抑制免疫细胞(DC、NK等)的抗肿瘤反应及诱导免疫耐受或调节细胞群(MDSC、Treg等)的免疫抑制。CD4
+
CD25
+
Foxp3
+
Treg释放含CD73的外泌体，抑制CD4
+
T细胞增殖，且活化的效应CD4
+
T细胞释放的外泌体通过特异性肽-MHC II/TCR和CD54/LFA-1相互作用被DC摄取，不仅能抑制CD4
+
T细胞增殖，还能抑制CD8
+
T细胞毒反应。而不同组织细胞释放的外泌体由于携带的组分不同而发挥不同生物学功能：如肿瘤细胞释放的外泌体介导血管再生、肿瘤细胞增殖及免疫逃避；DC释放的外泌体能引起机体产生有效的抗肿瘤免疫应答。
[0003]寄生虫排泄分泌物(excretory-secretory,ES)在寄生虫与宿主相互作用中具有重要作用，可通过下调宿主免疫应答以介导免疫抑制，最终帮助虫体建立感染。其中，外泌体是ES的重要组成部分，由细胞内多囊泡体与细胞膜融合，从而释放到胞外基质。寄生虫源外泌体与宿主相互作用，为寄生虫的生长发育和免疫逃避等提供基础。近年来研究认为，寄生虫通过释放外泌体或胞外囊泡与宿主细胞进行信息交流，尤其是RNA和蛋白质刺激宿主细胞引起的应答反应，为宿主细胞与寄生虫之间的相互作用研究开辟了新的篇章。外泌体可为RNA提供天然的稳定环境，不仅可作为载体将mRNA转运到特定的受体细胞中编码功能性蛋白，还可通过miRNA抑制受体细胞mRNA翻译从而调控基因表达，在疾病发展过程中具有重要调控作用，但其机制尚不清楚。
[0004]microRNA(miRNA)是一类大小约21～25nt的内源性单链非编码RNA，由约70～90个碱基大小的、具有发夹结构的单链RNA前体经过内切核酸酶Drosha和Dicer切割加工后生成。miRNAs可通过与靶基因特异性的碱基进行互补配对，导致其mRNA降解或抑制其翻译，从而在转录后水平对基因进行调控。miRNAs广泛存在于细菌、病毒、寄生虫以及动植物等多种生物中，并在生物体的各种生命活动过程中发挥重要作用，miRNAs的发现有利于阐明一些疾病的免疫机制及开发新型的诊断及治疗工具手段。miRNAs参与基因转录后调控，广泛参与寄生虫形态性别分化、生长发育、营养代谢和感染致病等生物学过程。目前，miRNAs成为寄生虫与宿主相互作用中的研究热点，特别是调控宿主免疫应答的研究。已有研究表明，寄生虫能以外泌体为载体将miRNAs转运到宿主细胞中，调控宿主免疫应答。
[0005]lncRNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一类长链非编码RNA分子，其转录本长
度大于200核苷酸，缺乏蛋白编码功能的；开始被认为是基因组转录的“噪音”，RNA聚合酶II转录产生的副产物，没有生物学功能。此后越来越多的研究表明，lncRNA在转录水平、转录后水平和表观遗传水平等多个层面调控基因表达，可作为分子信号、向导和支架，以及诱导分子参与细胞新陈代谢、增殖分化、免疫应答和致癌作用等生物学过程，在众多疾病的发生发展过程中起重要作用。另外，lncRNA可参与调控寄生虫性别分化、生长发育、生理代谢和感染致病等相关基因表达。
[0006]众所周知，寄生虫和宿主之间可进行物质交换，如蛋白质和核酸等生物大分子，可利用囊泡为载体穿过角皮层。研究表明，细粒棘球蚴体外培养时能释放外泌体，这可能是因为细胞外InsP6(肌醇六磷酸)与棘球蚴外泌体上的蛋白质结合，促进外泌体穿过角皮层。最近的研究证实，寄生虫源的外泌体参与虫体间的通讯，宿主的免疫应答和病理反应，其中外泌体携带的ncRNAs在这些过程中发挥着至关重要的作用。综合分析寄生虫源的ncRNAs谱有助于了解寄生虫-宿主的相互作用。然而，细粒棘球绦虫来源的外泌体是否包含lncRNA，以及其含有miRNAs是否可以靶向宿主基因并调节免疫应答尚未见报道。

技术实现思路

[0007]本专利技术要解决的技术问题之一在于提供一种细粒棘球绦虫原头节源和囊液源外泌体非编码RNA表达谱分析方法。
[0008]本专利技术要解决的技术问题之二在于提供细粒棘球绦虫原头节源和囊液源外泌体非编码RNA序列。
[0009]本专利技术从自然感染细粒棘球蚴的羊肝中分离原头节和囊液，建立细粒棘球绦虫原头节体外培养体系，将收集的原头节培养上清和囊液进行差速超速离心获得原头节源外泌体(protoscoleces-exosome like vesicles,PSC-ELVs)和囊液源外泌体(hydatid fluid-exosome like vesicles，HF-ELVs)，通过电镜、粒径分析和Western blotting进行鉴定。采用高通量测序技术分析原头节和囊液来源的外泌体非编码RNAs(miRNAs、lncRNAs、circRNAs)表达谱，生物信息学技术分析两种外泌体ncRNAs的种类和表达量，并对表达量前20的miRNAs可能参与的生物学功能、信号通路及发挥作用的方式进行预测，构建lncRNA-miRNA-mRNA互相调控网络，并筛选可能参与宿主免疫调节的潜在miRNAs分子。
[0010]为解决上述技术问题，本专利技术是通过以下技术方案实现的：
[0011]在本专利技术的一方面，提供一种细粒棘球绦虫原头节源和囊液源外泌体非编码RNA表达谱分析方法，包括如下步骤：
[0012](1)细粒棘球绦虫原头节和囊液分离；
[0013](2)细粒棘球绦虫原头节体外培养；
[0014](3)细粒棘球绦虫原头节源和囊液源外泌体分离，获得原头节源外泌体PSC-ELVs和囊液源外泌体HF-ELVs；
[0015](4)透射电镜分析；
[0016](5)纳米粒径跟踪分析；
[0017](6)Western blotting；
[0018](7)miRNA文库构建及测序；
[0019](8)全转录组测序文库构建及测序分析；
[0020](9)ceRNA调控网络构建。
[0021]作为本专利技术优选的技术方案，步骤(1)具体为：采集自然感染细粒棘球蚴的绵羊肝脏，消毒后，用注射器穿刺棘球蚴吸取囊液，置于离心管自然沉降后，将上清转移至新的离心管，收集囊液；沉淀清洗，收本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种细粒棘球绦虫原头节源和囊液源外泌体非编码RNA表达谱分析方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)细粒棘球绦虫原头节和囊液分离；(2)细粒棘球绦虫原头节体外培养；(3)细粒棘球绦虫原头节和囊液源外泌体分离，获得原头节源外泌体PSC-ELVs和囊液源外泌体HF-ELVs；(4)透射电镜分析；(5)纳米粒径跟踪分析；(6)Western blotting；(7)miRNA文库构建及测序；(8)全转录组测序文库构建及测序分析；(9)ceRNA调控网络构建。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)具体为：采集自然感染细粒棘球蚴的绵羊肝脏，消毒后，用注射器穿刺棘球蚴吸取囊液，置于离心管自然沉降后，将上清转移至新的离心管，收集囊液；沉淀清洗，收集原头节。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)具体为：将步骤(1)分离的原头节重悬于RPMI 1640完全培养基中，接种于T75的细胞培养瓶中，加入抗生素和葡萄糖置于37℃，5％CO2培养箱；每12h收集一次原头节培养上清并更换新的培养基，并吸取部分原头节悬液，用1％台盼蓝染色计数判断其活性；将原头节在无血清培养基中培养7d，收集培养上清，-80℃保存。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)具体为：将收集的原头节培养上清和囊液分别置于离心管内，依次离心，去除大的死细胞和细胞碎片，过滤上清液；将过滤后的原头节培养上清和囊液，超速离心；沉淀用PBS洗涤，并以相同的速度进一步超离心纯化；最后将获得的原头节源外泌体PSC-ELVs和囊液源外泌体HF-ELVs分别重悬于PBS中，并保存在-80℃下直至使用。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)具体为：吸取纯化的PSC-ELVs和HF-ELVs悬浮液，滴加于铜网上，室温静置吸附1min，滤纸吸去残液后滴加适量的3％磷钨酸于铜网上，负染1min，室温干燥；透射电子显微镜，80kV下曝光以捕获图像。6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)具体为：用NanoSight LM10对外泌体进行纳米粒径跟踪分析，以确定PSC-ELVs和HF-ELVs的粒径大小和频率分布。7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(6)具体为：将ELV沉淀与5
×
SDS和1
×
PBS混合，100℃煮沸；取蛋白质样品在10％SDS-PAGE凝胶上分离，然后将蛋白质转移至聚偏二氟乙烯膜；含5％牛血清白蛋白的TBS-0.05％Tween 20中封闭1h，将膜与以下兔多克隆抗体，4℃过夜：抗14-3-3zeta/delta，抗烯醇酶和抗CD9抗体；然后用HRP偶联的山羊抗兔抗体，1：5 000，室温孵育30min；ECL蛋白质印迹检测系统对膜进行可视化检测。8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(7)具体包括如下：使用TruSeq Small RNA Sample Prep Kits进行文库构建，包括连接3
’
接头、连接5
’
接头、逆转录与扩增、PCR扩增、cDNA纯化、文库质检、测序、small RNA测序生物信息学分析、靶基因预测和KEGG信号通路分析；从miRNA文库中筛选获得的含量前20的miRNAs，具体序列见表2.3：
表2.3 PSC-ELVs和HF-ELVs中含量前20的miRNAs
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(8)具体包括如下：rRNA的去除和RNA的片段化、cDNA第一链的合成、cDNA第二链的合成、纯化、3
’
腺苷酸化、加入接头序列、DNA片段扩增、文库质检、文库测序、全转录组测序生物信息学分析；筛选获得的含量前20的lncRNAs和circRNAs，具体序列见下：所述含量前20的lncRNAs序列如下：TCONS_00010188，SEQ ID NO.32；TCONS_00043757，SEQ ID NO.33；TCONS_00019710，SEQ ID NO.34；TCONS_00038979，SEQ ID NO.35；TCONS_00035186，SEQ ID NO.36；TCONS_00003209，SEQ ID NO.37；TCONS_00012812，SEQ ID NO.38；
TCONS_00006741，SEQ ID NO.39；TCONS_00003723，SEQ ID NO.40；TCONS_00008820，SEQ ID NO.41；TCONS_00045933，SEQ ID NO.42；TCONS_00022564，SEQ ID NO.43；TCONS_00006744，SEQ ID NO.44；TCONS_00037088，SEQ ID NO.45；TCONS_00045359，SEQ ID NO.46；TCONS_00033685，SEQ ID NO.47；TCONS_00041870，SEQ ID NO.48；TCONS_00033683，SEQ ID NO.49；TCONS_00023720，SEQ ID NO.50；TCONS_00028851，SEQ ID NO.51；所述含量前20的circRNAs序列如下：circRNA_1446|NW_020170512.1:99291_101910_+，SEQ ID NO.52；circRNA_0954|NW_020170426.1:442447_444227_+，SEQ ID NO.53；circRNA_1451|NW_020170514.1:127624_127892_-，SEQ ID NO.54；circRNA_1018|NW_020170433.1:274224_277812_-，SEQ ID NO.55；circRNA_1422|NW_020170505.1:163194_163647_+，SEQ ID NO.56；circRNA_1186|NW_020170455.1:368977_373090_-，SEQ ID NO.57；circRNA_0728|NW_020170407.1:421342_430823_-，SEQ ID NO.58；circRNA_0626|NW_020170400.1:930889_932125_-，SEQ ID NO.59；circRNA_0717|NW_020170406.1:798341_800017_-，SEQ ID NO.60；circRNA_1031|NW_020170435.1:23386_25851_+，SEQ ID NO.61；circRNA_1518|NW_020170551.1:50317_54018_+，SEQ ID NO.62；circRNA_0865|NW_020170419.1:115979_116422_+，SEQ ID...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈玉娟，张小凡，曹建平，曹胜魁，张璟，
申请(专利权)人：中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所国家热带病研究中心，
类型：发明
国别省市：