一种与猪有腔卵泡闭锁相关的circRNA、其siRNA抑制剂及其应用制造技术

本发明专利技术属于家畜分子生物学技术领域，具体涉及一种与猪有腔卵泡闭锁相关的circRNA、其siRNA抑制剂及其应用；所述circRNA为circSLC41A1，其线性核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；本发明专利技术针对circSLC41A1设计特异性扩增引物，经PCR扩增、RNase R酶消化及荧光原位杂交验证所述的circSLC41A1的真实存在；利用荧光定量PCR检测到circSLC41A1在猪卵巢中健康有腔卵泡组织中表达高于闭锁卵泡，用siRNA干扰技术证实circSLC41A1对颗粒细胞凋亡具有显著抑制作用；同时，本发明专利技术设计并提供一种可作为circSLC41A1抑制剂的小RNA；本发明专利技术公开的circSLC41A1有望作为母猪繁殖相关的分子标志物，为猪繁殖性状的评价，繁殖力提升，为人类卵泡异常相关疾病的发生和预防提供新的理论基础和潜在的分子标靶。础和潜在的分子标靶。础和潜在的分子标靶。

【技术实现步骤摘要】
一种与猪有腔卵泡闭锁相关的circRNA、其siRNA抑制剂及其应用


[0001]本专利技术属于家畜分子生物学
，具体涉及一种与猪有腔卵泡闭锁相关的circRNA、其siRNA抑制剂及其应用。

技术介绍

[0002]雌性动物的生殖性能，尤其是产仔数与其排卵数量紧密相关。卵泡闭锁是哺乳动物卵泡发育过程中的一种自然生理现象。在母猪出生前后，其原始卵泡腔形成，其卵泡储备含有大约500万个原始卵泡。然而在生长发育及发情周期过程中，大量卵泡在直径达到6毫米之前发生闭锁和消失，导致最终可实现的排卵率低于14％。作为卵泡的主要组成部分，颗粒细胞通过与卵母细胞和卵泡膜细胞密切相互作用并产生旁分泌物质而发挥功能。研究表明，颗粒细胞增殖和功能在卵泡发育和成熟中至关重要，而颗粒细胞凋亡率随着卵泡闭锁的进展而显著增加，因此颗粒细胞凋亡水平是卵泡闭锁的主要标志之一。
[0003]环状RNA(circRNA)是由前体mRNA通过前体RNA的反向剪接产生的一种新型非编码RNA，是由线性RNA3
’
端与5
’
端共价连接形成的闭合环状分子，其分布广泛、保守性高、结构稳定不被RNaseR剪切降解。今年来，在高通量测序技术的支持下，circRNA的广泛分布在多种动、植物细胞和组织中被证实。它们位于细胞核或细胞质中，通过转录(如与RNA结合蛋白相互作用)或转录后途径(如吸附miRNA)调节基因表达。越来越多的研究指出，circRNA在细胞分化、发育和功能障碍中具有重要作用。目前circRNA在母猪繁殖尤其是卵泡闭锁机制方面研究还较少，因此寻找影响母猪繁殖性能的circRNAs成为当前母猪繁殖与遗传育种研究及卵巢功能研究的新方向。

技术实现思路

[0004]为了达到上述目的，本专利技术提供一种与猪有腔卵泡闭锁相关的circRNA，所述的circRNA为circSLC41A1，circSLC41A1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0005]本专利技术提供一种用于检测样品中circSLC41A1表达水平的试剂，所述circSLC41A1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述试剂含有特异性扩增circSLC41A1的引物对或特异性标记circSLC41A1的荧光原位杂交探针。
[0006]优选地，所述引物对的序列如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3。
[0007]优选地，所述探针的序列如SEQ ID NO:4所示。
[0008]本专利技术提供一种circSLC41A1抑制剂siRNA，所述siRNA序列如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示。
[0009]本专利技术提供上述circRNA在动物细胞和组织表达量检测中的应用。
[0010]本专利技术提供上述circRNA在母猪的选择评定、配种以及遗传改良中的应用。
[0011]本专利技术提供上述试剂在动物细胞和组织表达量检测中的应用。
[0012]本专利技术提供上述试剂在母猪的选择评定、配种以及遗传改良中的应用。
[0013]可以有效检测circRNA在动物细胞或组织中相对表达量，即以circRNA特异引物进行实时定量PCR的方法进行检测；circRNA在猪健康有腔卵泡中的表达量极显著高于闭锁卵泡。
[0014]可以有效检测circRNA在动物细胞或组织中定性分布，即以circRNA特异探针进行荧光原位杂交的方法进行检测，circRNA在猪健康卵巢颗粒细胞细胞质中有较高分布，在细胞核中表达极低。
[0015]本专利技术提供一种circSLC41A1抑制剂siRNA在母猪卵巢疾病及卵巢异常治疗药物中的应用，可用于circSLC41A1在细胞、组织、活体中的定向敲减，即脂质体介导的siRNA转染干扰的方法。本专利技术的siRNA经脂质体转染颗粒细胞后能有效降低颗粒细胞中相应circRNA表达量，显著提高猪卵巢颗粒细胞凋亡。
[0016]本专利技术提供了一种纯化circRNA及对其环状结构鉴定的方法。具体步骤如下：
[0017](1)以RNase R酶消化猪卵巢有腔卵泡环状RNA；
[0018](2)以GAPDH为对照，以cDNA、gDNA为模板，利用Divergent Primer和SLC41A1 mRNA Primer进行扩增；
[0019](3)以GAPDH为内参基因，利用qRT
‑
PCR检测circRNA对RNase R酶的耐受性。
[0020]本专利技术的circRNA Divergent扩增引物及SLC41A1mRNA引物如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3以及SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示；GAPDH引物如SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10所示。
[0021]与现有技术相比，本专利技术具有如下优点和有益效果：
[0022]本专利技术提供的circRNA结构稳定且与猪卵泡闭锁相关性高，可作为卵泡健康或闭锁状况鉴定的直接指征或判断依据之一。该circRNA可作为分子育种过程中母猪繁殖性能筛选的分子标记，亦可作为人工干涉卵泡发育或闭锁过程的靶点。本专利技术提供的相关检测试剂中的定量引物和荧光探针特异性强，能明确反应该circRNA的表达水平和亚细胞分布情况。本专利技术提供的siRNA抑制剂特异性强且效果显著。
附图说明
[0023]图1为circSLC41A1反向剪切结构、Divergent定量扩增引物的设计及反向剪接位点测序图；
[0024]图2为RNaseR消化处理后样品中线性mRNA与circRNA表达量的对比图；
[0025]图3为circSLC41A1在猪健康卵巢颗粒细胞细胞质中分布图，其中，左图：荧光探针标记的circSLC41A1，中图：DAPI染色标记的细胞核，右图：merge，即前两张图的重叠图；
[0026]图4为circSLC41A1在猪健康有腔卵泡和闭锁卵泡中的表达量对比图；
[0027]图5为siRNA经脂质体转染颗粒细胞后相应circRNA表达量；
[0028]图6为特异性敲减circRNA后猪卵巢颗粒细胞凋亡率；左图为流式细胞仪检测结果原图；右图为经统计分析处理后的结果图。
具体实施方式
[0029]以下将结合具体实施例对本专利技术提供的技术方案进行详细说明，应理解下述具体实施方式仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。
qRTSuperMix II 4ul,混匀，50℃15min，85℃5s。
[0052](6)PCR及Sanger测序
[0053]PCR扩增体系：1μL模板，上、下游引物(SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3)各10μM，2
×
ESTaqMasterMix 5μL(购自Vazyme南京有限公司)，加ddH2O至10μl。95℃预变性5min；35个循环(95℃变性30s；60℃退火30s；72℃延伸20s)；72℃10min本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种与猪有腔卵泡闭锁相关的circRNA，其特征在于，所述的circRNA为circSLC41A1，circSLC41A1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。2.一种用于检测样品中circSLC41A1表达水平的试剂，其特征在于，所述circSLC41A1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述试剂含有特异性扩增circSLC41A1的引物对或特异性标记circSLC41A1的荧光原位杂交探针。3.根据权利要求2所述的试剂，其特征在于，所述引物对的序列如SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3所示。4.根据权利要求2所述的试剂，其特征在于，所述探针的序列如SEQ ID NO:4所...

【专利技术属性】
技术研发人员：张金璧，徐世永，茅慧华，刘京鸽，陈清，
申请(专利权)人：金陵科技学院，
类型：发明
国别省市：