一对用于肉源鉴定的通用引物及其应用制造技术

本发明专利技术属于核酸检测领域，具体为一对能够同时扩增牛，羊，猪，鸡，鸭，驴，马，鼠，狐，兔，狗的11种肉源基因的通用引物，能够用于PCR和RPA的扩增，且扩增子具有良好的特异性。该引物能够在扩增完成后进行sanger测序，用于肉源鉴定。也可以在扩增后结合CRISPR/Cas12a体系，利用体系的反式切割活性以荧光指示信号，用于肉类掺假的检测。类掺假的检测。类掺假的检测。

【技术实现步骤摘要】
一对用于肉源鉴定的通用引物及其应用


[0001]本专利技术属于生物检测技术，具体涉及一对用于肉源鉴定的通用引物及其应用。

技术介绍

[0002]在食品安全领域，肉类掺假是一个重要的研究方向，掺假的主要形式主要为低价值的肉类掺入到高价值的肉类中，如猪，鸡，鸭肉掺入到牛羊肉中，也有报道狐狸肉，老鼠肉冒充羊肉销售的报道。特别是近年来，掺假对象从原来的冷鲜肉和简单加工肉品渗入到多个种类的产品，尤其是现代深加工肉品，掺假手段方法也更加多样。DNA条形码技术早已应用于肉类掺假的鉴别中，以经典的PCR为例，可以使用特异性引物扩增后进行琼脂糖凝胶电泳来定性分析。但一个关键的问题无论是LAMP，RPA还是PCR扩增技术，引物二聚体与非特异性扩增产物是无法避免的，这会导致假阳性的问题。

技术实现思路

[0003]本专利技术公开了一对通用引物，既可以应用于RPA，也可以应用于PCR，通过通用引物扩增结合测序的方法能够应用于物种肉源的鉴定，也可以在扩增后结合CRISPR/Cas12a体系，通过设计物种特异性的crRNA，激活体系反式切割活性切割荧光基团来指示靶标信号。
[0004]本专利技术采用如下技术方案：一对用于肉源鉴定的通用引物，由上游引物、下游引物组成，其中上游引物为CTAAGGCACGTACATACCGCCCGTCACCCTC；下游引物为CACCTTCCGGTACACTTACCTTGTTACGACTT。
[0005]本专利技术公开了上述用于肉源鉴定的通用引物在检测肉源食品中的应用；优选的，肉为牛，羊，猪，鸡，鸭，驴，马，鼠，狐，兔，狗中的一种或几种。
[0006]本专利技术公开了一种用于肉源鉴定的RPA反应体系，包括上述用于肉源鉴定的通用引物以及常规组分；常规组分为RPA缓冲液、DNA模板、ddH2O、基础扩增试剂以及无机镁盐。优选的，RPA反应的温度为37℃，时间为15～30min，优选30min。
[0007]本专利技术公开了一种用于肉源鉴定的PCR反应体系，包括上述用于肉源鉴定的通用引物以及常规组分；常规组分为PCR预混液、DNA模板、双蒸水。优选的，PCR反应的过程为94℃预变性5min，然后94℃保持30s、58℃保持30s、72℃保持30s，34个循环，最后72℃保持5min。
[0008]本专利技术公开了一种用于肉源鉴定的方法，将肉源基因模板、上述用于肉源鉴定的通用引物以及RPA常规组分混合后，在37℃保持15～30min，然后将PRA产物进行凝胶电泳分析，完成肉源鉴定；或者将肉源基因模板、上述用于肉源鉴定的通用引物以及PCR常规组分混合后，在94℃预变性5min，然后94℃保持30s、58℃保持30s、72℃保持30s，34个循环，最后72℃保持5min，然后将PCR产物进行凝胶电泳分析，完成肉源鉴定。本专利技术公开了一对通用引物，既可以应用于RPA，也可以应用于PCR，通过通用引物扩增结合测序的方法能够应用于物种肉源的鉴定，也可以在扩增后结合CRISPR/Cas12a体系，通过设计物种特异性的crRNA，激活体系反式切割活性切割荧光基团来指示靶标信号。本专利技术的创造性在于公开了通用引
物，产物后续测试为常规技术，比如凝胶电泳、CRISPR/Cas12a体系等，为现有技术。
[0009]本专利技术公开了上述用于肉源鉴定的RPA反应体系或者用于肉源鉴定的PCR反应体系在检测肉源食品中的应用；优选的，肉为牛，羊，猪，鸡，鸭，驴，马，鼠，狐狸，兔，狗中的一种或几种。
[0010]通用引物结合CRISPR体系的应用解决了现有技术假阳性的问题，通用引物的前置扩增为整个体系提供了灵敏度的要求，而crRNA识别扩增产物为体系提供了的特异性保障；并且在物种鉴定领域，通用引物+sanger测序是一种非常经典的方法，本专利技术所筛选出的一对牛，羊，猪，鸡，鸭，驴，马，鼠，狐，兔，狗的通用引物，可以应用于食品安全领域。
附图说明
[0011]图1为实施例RPA产物的凝胶电泳图；图2为实施例PCR产物的凝胶电泳图；图3为实施例PCR产物的测序结果；图4为对比例RPA产物的凝胶电泳图；图5为对比例PCR产物的凝胶电泳图。
具体实施方式
[0012]本专利技术的实验材料以及具体操作方法都是本领域常规方法，引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成，序列测序以及比对为现有常规技术。
[0013]主要仪器主要试剂耗材DNA提取依照柱式动物线粒体DNAout试剂盒的说明，依照步骤提取牛、羊、猪、鸡、鸭、驴、
马、鼠、狐、兔、狗的DNA，并将其稀释至10ng/ul以准备加入在PCR与RPA中验证引物的通用性。
[0014]实施例 引物设计上游引物：CTAAGGCACGTACATACCGCCCGTCACCCTC下游引物：CACCTTCCGGTACACTTACCTTGTTACGACTT引物通用性的验证RPA反应。首先制备反应液：上游引物、下游引物（10
µ
M）各2.4
ꢀµ
l；RPA缓冲液29.5
ꢀµ
l；DNA模板 1
ꢀµ
l；ddH2O12.2
ꢀµ
l；然后将反应液与基础扩增试剂TwistAmp Basic混合，再加入2.5 μl 280mM的MgOAc溶液启动反应，在37℃放置30min反应完成；使用同体积抽提液（苯酚:氯仿:异戊醇=25:24:1）纯化扩增产物，混匀后12000rpm/min离心5min，取上清电泳。
[0015]PCR反应。PCR反应体系：PCR反应程序：琼脂糖凝胶电泳检测琼脂板放入电泳池，贴紧边缘，mark(100bp)进样1.5
µ
L，PCR产物进样4.5
µ
L，RPA产物进样6
µ
L。电泳程序：U=140VI=200mAt=30min。
[0016]实验结果在RPA体系中分别加入牛，羊，猪，鸡，鸭，驴，马，鼠，狐，兔，狗的肉源基因组作为模板（10ng/
µ
L），经RPA反应并纯化扩增产物，进行电泳，结果如图1所示。如图1所示，牛，羊，
猪，鸡，鸭的目标条带单一且清晰明亮，显示出良好的通用性与扩增效率；且通过对驴，马，鼠，狐，兔，狗这6个物种验证，该引物具备驴，马，鼠，狐，兔，狗的RPA扩增的通用性，其中驴，鼠，狐的扩增效率良好；马，兔，狗的扩增效率稍差。
[0017]在PCR体系中分别加入牛，羊，猪，鸡，鸭，驴，马，鼠，狐狸，兔，狗的肉源基因组作为模板（10ng/
µ
L），经PCR反应后产物进行电泳，结果如图2所示，所示PCR电泳图中该引物对11个物种均具备扩增效率，相比于先前进行的RPA反应电泳图中马，兔，狗的条带略微暗淡、扩增效率稍差，该引物在PCR体系中似乎更能体现出其通用性的优势。
[0018]本专利技术的引物适用RPA，在PCR体系中也具有通用性，增加了该引物对的应用途径。
[0019]扩增产物特异性的验证使用通用引物进行扩增后，需要进行测序本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一对用于肉源鉴定的通用引物，由上游引物、下游引物组成，其特征在于，上游引物为CTAAGGCACGTACATACCGCCCGTCACCCTC；下游引物为CACCTTCCGGTACACTTACCTTGTTACGACTT。2.权利要求1所述用于肉源鉴定的通用引物在检测肉源食品中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，肉为牛、羊、猪、鸡、鸭、驴、马、鼠、狐、兔、狗中的一种或几种。4.一种用于肉源鉴定的RPA反应体系，其特征在于，包括权利要求1所述用于肉源鉴定的通用引物以及常规组分。5.根据权利要求4所述用于肉源鉴定的RPA反应体系，其特征在于，RPA反应的温度为37℃，时间为15～30min。6.一种用于肉源鉴定的PCR反应体系，其特征在于，包括权利要求1所述用于肉源鉴定的通用引物以及常规组分。7.根据权利要求6所述用于肉源鉴定的PCR反应体系，其特征在于，PCR反应的过程为9...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙万平，丁威，张玲，方坛芬，刘岩，
申请(专利权)人：苏州大学，
类型：发明
国别省市：