一种与猪有腔卵泡闭锁相关的miRNA分子及其应用制造技术

本发明专利技术属于家畜分子生物学技术领域，具体涉及一种与猪有腔卵泡闭锁相关的microRNA(miRNA)及其应用；所述miRNA为miR

【技术实现步骤摘要】
一种与猪有腔卵泡闭锁相关的miRNA分子及其应用


[0001]本专利技术属于家畜分子生物学
，具体涉及一种与猪有腔卵泡闭锁相关的miRNA及其应用。

技术介绍

[0002]雌性动物的生殖性能，尤其是产仔数与其排卵数量紧密相关。卵泡闭锁是哺乳动物卵泡发育过程中的一种自然生理现象。在母猪出生前后，其原始卵泡腔形成，其卵泡储备含有大约500万个原始卵泡。然而在生长发育及发情周期过程中，大量卵泡在直径达到6毫米之前发生闭锁和消失，导致最终可实现的排卵率低于14％。作为卵泡的主要组成部分，颗粒细胞通过与卵母细胞和卵泡膜细胞密切相互作用并产生旁分泌物质而发挥功能。研究表明，颗粒细胞增殖和功能在卵泡发育和成熟中至关重要，而颗粒细胞凋亡率随着卵泡闭锁的进展而显著增加，因此颗粒细胞凋亡水平是卵泡闭锁的主要标志之一。
[0003]微小RNA(microRNA，miRNA)是一类由内源基因编码的长度约为20
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24个核苷酸的非编码单链RNA分子，一般通过转录抑制或转录后降解广泛参与基因表达的调节过程。研究发现有15
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30％的动物基因组由miRNA直接调控，人类中1/3的基因都受到miRNA的调控。miRNA分布广泛，参与细胞生长、分化、凋亡、增殖等生物过程。2007年，miRNA在卵母细胞发育、成熟的调控的参与在Dicer酶基因敲除的小鼠模型中首次得到证实。2010年，miR
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21成为第一个被证实在哺乳动物卵泡颗粒细胞凋亡中发挥作用的miRNA，近年来发现miRNA在卵母细胞、卵泡膜细胞和黄体细胞中均发挥的重要调控作用，提示了miRNA在卵泡闭锁过程中的调控作用和应用潜力。

技术实现思路

[0004]为了达到上述目的，本专利技术提供一种与母猪繁殖相关的miRNA，所述的miRNA为猪miR
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5p，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0005]本专利技术提供了一种用于检测样品中miR
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5p表达水平的试剂，所述miR
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5p的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述试剂含有特异性扩增miR
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5p的反转录茎环引物及可用于荧光定量PCR检测的上游引物，或特异性标记miR
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5p的荧光原位杂交探针；所述特异性反转录miR
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5p的茎环引物的序列如SEQ ID NO:2所示；
[0006]本专利技术提供了一种特异性扩增miR
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5p，并可用于荧光定量PCR检测的上游引物，该上游引物的序列如SEQ ID NO:3所示，配合miRNA扩增通用下游引物使用，该通用下游引物的序列如SEQ ID NO:10所示；提供一种特异性标记miR
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5p的原位杂交探针，该探针的序列如SEQ ID NO:4所示。
[0007]本专利技术提供了一种miR
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5p的特异性mimics双链序列，该mimics序列如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示。
[0008]本专利技术提供了一种miR
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5p的特异性inhibitor序列，该inhibitor序列如SEQ ID NO:7所示。
[0009]本专利技术提供的miRNA在动物细胞和组织表达量检测中的应用。
[0010]本专利技术提供的miRNA在母猪的选择评定、配种、遗传改良以及卵巢病理检测中的应用。
[0011]本专利技术提供的试剂在动物细胞和组织表达量检测中的应用。
[0012]本专利技术提供的试剂在母猪的选择评定、配种、遗传改良以及卵巢病理检测中的应用。
[0013]本专利技术提供的mimics序列在用于加强所述的miRNA的处理中的应用；所述的miR
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5p的特异性mimics序列，可用于miR
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5p在细胞、组织、活体中的功能性上调。
[0014]本专利技术提供的inhibitor序列在用于抑制所述的miRNA的处理中的应用；所述的miR
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5p的特异性inhibitor序列，可用于miR
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5p在细胞、组织、活体中的功能性下调。
[0015]与现有技术相比，本专利技术具有如下优点和有益效果：
[0016]本专利技术提供的一种与猪有腔卵泡闭锁相关的microRNA(miRNA)及其应用；所述miRNA为miR
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5p，其线性核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；本专利技术针对miR
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5p设计特异性杂交探针，经荧光原位杂交验证所述的miR
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5p的真实存在；针对miR
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5p设计特异性扩增引物，经荧光定量PCR检测到miR
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5p在猪卵巢中健康有腔卵泡组织中表达低于闭锁卵泡，用相应类似物和抑制物处理证实miR
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5p对颗粒细胞凋亡具有显著促进作用；同时，本专利技术设计分别提供miR
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5类似物和抑制物的核苷酸序列；本专利技术公开的miR
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5p有望作为母猪繁殖相关的分子标志物，为猪繁殖性状的评价，繁殖力提升，为人类卵泡异常相关疾病的发生和预防提供新的理论基础和潜在的分子标靶。
[0017]本专利技术提供的miRNA序列短小、转录快且与猪卵泡闭锁相关性高，可作为卵泡健康或闭锁状况鉴定的直接指征或判断依据之一。由于miRNA可直接通过腹腔或组织注射等方式发挥作用，因此该miRNA还可作为人工干涉卵泡发育或闭锁过程的工具。本专利技术提供的相关检测试剂中的反转录茎环引物及其配套定量引物和荧光探针特异性强，能明确反应该miRNA的表达水平和亚细胞分布情况。本专利技术提供的mimics和inhibitor对miRNA生物学作用的促进和抑制效果显著且特异性强。
附图说明
[0018]图1为qRT
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PCR检测miR
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5p在猪健康、闭锁有腔卵泡中的表达量；
[0019]图2为荧光原位杂交检测猪颗粒细胞中miR
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5p的分布图，其中，左图为绿色荧本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种与猪有腔卵泡闭锁相关的miRNA分子，其特征在于，所述的miRNA为miR
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5p，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。2.一种用于检测样品中miR
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5p表达水平的试剂，其特征在于，所述miR
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5p的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述试剂含有特异性扩增miR
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5p的反转录茎环引物及可用于荧光定量PCR检测的上游引物，或特异性标记miR
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5p的荧光原位杂交探针；所述反转录茎环引物和相应荧光定量PCR检测的上游引物的序列如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示，与SEQ ID NO:3配合使用的荧光定量PCR检测的通用下游引物如SEQ ID NO:10所示；所述探针的序列如SEQ I...

【专利技术属性】
技术研发人员：张金璧，徐世永，茅慧华，刘京鸽，陈清，
申请(专利权)人：金陵科技学院，
类型：发明
国别省市：