新冠病毒包膜蛋白突变体侵入能力非诊断评价方法技术

本申请提供了一种新冠病毒包膜蛋白突变体侵入能力非诊断评价方法，其中使用了基于HIV/Luc报告载体的假病毒以及跨膜丝氨酸蛋白酶瞬时转染的稳定表达人ACE2受体的细胞。本发明专利技术还提供了相应假病毒产品及其应用。明还提供了相应假病毒产品及其应用。明还提供了相应假病毒产品及其应用。

【技术实现步骤摘要】
新冠病毒包膜蛋白突变体侵入能力非诊断评价方法


[0001]本申请属于微生物领域，具体地，属于病毒感染研究领域。本申请提供了一种新冠病毒包膜蛋白突变体侵入能力非诊断评价方法。

技术介绍

[0002]SARS
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CoV
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2的包膜蛋白S蛋白介导病毒吸附和侵入细胞的过程，是影响新冠病毒侵入能力的主要因素。在新冠病毒流行期间，已经出现多种包膜蛋白突变毒株，其中D614G株在2020年3月出现，目前已成为主要流行株，有研究证明该突变株传播能力较之前更强；此外在2020年9月于英国出现的英国超级株也显示出更强的传播能力；在不同新冠肺炎患者的标本中可以发现多种不同的新型冠状病毒包膜突变体。虽然评估病毒侵入能力最直接的方法是使用活病毒的感染试验或空斑形成试验，但首先不同新冠病毒包膜突变体的来源较为分散，难以获得研究所需的突变体活病毒；其次活病毒的操作必须在BSL
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3实验室中进行；另外,活病毒在扩增和传代过程中易发生基因突变且培养条件和结果判读标准的不同，不同实验室的活病毒检测结果常常存在较大差异。
[0003]因此，提供一种操作简单、安全、准确的新冠病毒包膜蛋白突变体侵入能力评价方法对新冠病毒的研究、疾控和个体诊断都有重要的意义。

技术实现思路

[0004]SARS
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CoV
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2活病毒应用于相关分析试验中存在种种局限，本专利技术建立了一种基于HIV/Luc报告载体的假病毒检测系统，用于研究SARS
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>CoV
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2包膜蛋白不同突变体侵入靶细胞能力，操作相对安全，检测结果更加稳定。将经过密码子优化的C末端缺失19个氨基酸的S蛋白插入假病毒颗粒中，产生的假病毒将以与活病毒相同的方式进入细胞。
[0005]本研究中构建的假病毒可用于评价所有新冠病毒包膜蛋白突变体侵入细胞的能力，并且可以进一步用于评价中和抗体以及针对S蛋白设计的小分子药物在阻止病毒进入细胞方面的效果等的以病毒侵入靶细胞过程为对象的研究。本研究通过将HIV/Luc骨架质粒与不同S蛋白突变体表达质粒共转染293T细胞以制备假病毒，同时用跨膜丝氨酸蛋白酶(TMPRSS2)瞬时转染的稳定表达人ACE2受体的T
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REx293细胞作为靶细胞评价假病毒进入的水平。TMPRSS2是一种定位于细胞表面的蛋白酶，在病毒入侵过程中对冠状病毒的S蛋白进行切割而预激活，促进其进入靶细胞。本研究中构建的假病毒带有荧光素酶报告基因，可以通过荧光测定仪精确地检测报告基因的表达,实现病毒的定量检测。通过替换不同的S蛋白突变体表达质粒，即可研究不同S蛋白突变体侵入能力，该假病毒检测系统还可以用于研究病毒的组织嗜性和受体识别方式、中和抗体对不同突变体作用变化以及针对S蛋白作用的小分子抗病毒药物的效果。
[0006]本申请新冠病毒包膜蛋白突变体侵入能力评价技术的实现包括：1.基于HIV/Luc骨架的表达新冠病毒包膜蛋白突变体的假病毒单轮感染系统建立；2.人ACE2(hACE2)受体诱导表达靶细胞T
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REx 293
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hACE2的构建；3.通过在靶细胞T
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REx 293
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hACE2中同时表达
TMPRSS2，对SARS
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CoV
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2假病毒预激活从而提高其感染量；
[0007]一方面，本申请提供了一种新冠病毒包膜蛋白突变体侵入能力非诊断评价方法，其中使用了基于HIV骨架的表达新冠病毒包膜蛋白突变体的假病毒。
[0008]进一步地，所述基于HIV骨架的表达新冠病毒包膜蛋白突变体的假病毒是通过将HIV/Luc骨架质粒与不同S蛋白突变体表达质粒共转染来制备的。
[0009]进一步地，共转染的对象为293T细胞。
[0010]进一步地，所述HIV/Luc骨架质粒为pNL4
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3.Luc.R
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E
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。
[0011]进一步地，所述方法中还使用了稳定表达人ACE2受体的T
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REx 293细胞作为靶细胞。
[0012]进一步地，所述靶细胞以跨膜丝氨酸蛋白酶瞬时转染。
[0013]另一方面，本申请提供了一种基于HIV骨架的表达新冠病毒包膜蛋白突变体的假病毒。
[0014]进一步地，所述基于HIV骨架的表达新冠病毒包膜蛋白突变体的假病毒是通过将HIV/Luc骨架质粒与不同S蛋白突变体表达质粒共转染293T细胞来制备的。
[0015]进一步地，所述HIV/Luc骨架质粒为pNL4
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3.Luc.R
‑
E
‑
。
[0016]另一方面，本申请提供了上述假病毒在制备包膜蛋白突变体侵入能力研究试剂组中的应用。
[0017]本申请的方法和假病毒可用于诊断或非诊断用途，优选地，用于新冠病毒相关科学研究，疾控数据统计和研判等非诊断用途。
[0018]本申请中的S蛋白、S蛋白突变体可以为自样本中分离的蛋白或者人工表达制备的蛋白；pNL4
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3.Luc.R
‑
E
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有市售产品，也可以根据相关文献构建。
附图说明
[0019]图1为HIV/Luc报告基因结构及基于HIV/Luc报告载体的假病毒包装示意图；
[0020]图2为假病毒滴度测定示意图，周围一圈用250μl DMEM或无菌水液封，以便减少“边缘效应”的影响。B11
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G11为细胞对照孔，B2
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G10为倍比稀释孔；
[0021]图3为表达hACE2和TMPRSS2的T
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REx 293靶细胞感染平台和病毒侵入系统构建示意图；
[0022]图4为SARS
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CoV
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2病毒进入宿主细胞的检测。其中上图为假病毒侵入实验荧光显微镜观察结果(该假病毒系统带有EGFP报告基因，可用荧光显微镜检测)：Tet+表示加入四环素，Tet
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表示未加四环素；表达hACE2受体和TMPRSS2的T
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REx 293细胞可以有效支持SARS
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CoV和SARS
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CoV
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2假病毒的侵入，却不能支持MERS
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CoV假病毒侵入；下图为三种假病毒侵入效率的直方图。
[0023]图5为本申请的评价方法用于评价多种S蛋白突变体时的结果图。
具体实施方式
[0024]为让本领域的技术人员更加清晰直观的了解本专利技术，下面将结合附图，对本专利技术作进一步的说明。
[0025]实施例1基于HIV骨架的表达新冠病毒包膜蛋白突变体的假病毒单轮感染系统的
构建
[0026](1)S蛋白表达质粒的构建：
[0027]本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种新冠病毒包膜蛋白突变体侵入能力非诊断评价方法，其特征在于，其中使用了基于HIV骨架的表达新冠病毒包膜蛋白突变体的假病毒。2.根据权利要求1所述的评价方法，其特征在于，其中所述基于HIV骨架的表达新冠病毒包膜蛋白突变体的假病毒是通过将HIV/Luc骨架质粒与不同S蛋白突变体表达质粒共转染来制备的。3.根据权利要求2所述的评价方法，其特征在于，其中所述共转染的对象为293T细胞。4.根据权利要求2或3所述的评价方法，其特征在于，其中所述HIV/Luc骨架质粒为pNL4
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3.Luc.R
‑
E
‑
。5.根据权利要求1
‑
4任一项所述的评价方法，其特征在于，其中还使用了稳定表达人...

【专利技术属性】
技术研发人员：李星霖，陈丹瑛，赵学森，刘永梅，邱雅若，
申请(专利权)人：首都医科大学附属北京地坛医院，
类型：发明
国别省市：