一种快速筛选CRISPR-Cas9基因组编辑gRNA靶位点的方法技术

本发明专利技术公开了一种快速筛选CRISPR

【技术实现步骤摘要】
一种快速筛选CRISPR
‑
Cas9基因组编辑gRNA靶位点的方法


[0001]本专利技术涉及基因编辑
，更具体的说是涉及一种快速筛选CRISPR
‑
Cas9基因组编辑gRNA靶位点的方法。

技术介绍

[0002]目前，基因组编辑技术，特别是基于CRISPR/Cas9的基因组编辑技术已广泛应用于动植物基因的功能和分子育种工作。CRISPR/Cas9的基因组编辑主要由Cas9蛋白与sgRNA(single
‑
guide RNA)组成，靶位点通常由20碱基的碱基序列构成，靶点的3
′
端连有PAM序列，Cas9蛋白的PAM序列为NGG，N为任意碱基。Cas9蛋白与gRNA结合后，先识别基因组PAM序列，然后通过gRNA与靶序列DNA链互补配对，完成靶位点的定位过程，定点后Cas9蛋白在离PAM序列3
‑
4碱基的位置进行切割靶点DNA的两条链，从而形成DSB结构，然后细胞启动自我修复机制，在DNA切口处产生碱基丢失、插入或替换，造成基因的突变，实现对目的基因精确的编辑。
[0003]然而，现有研究发现，对于同一个基因，不同靶位点产生的基因组编辑效率差异很大；而且，基因组编辑突变的实现是基于稳定的遗传转化体系的，对于植物特别是园艺作物来说，其稳定的遗传转化体系的效率低，周期长。如香蕉的遗传转化周期长达1
‑
2年。为了快速高效的得到基因组编辑突变材料，很有必要在进行稳定的基因组编辑株系创制前，对不同靶位点的gRNA的编辑突变效率进行筛选，挑选高活性的靶位点进行稳定转化操作。目前，进行gRNA活性检测的方法主要两种：一种是PCR
‑
RE，需要设计含有限制性内切酶位点的靶位点，这样使可选择靶位点的数量受到很大限制；另一种是PCR扩增子高通量二代测序方法，该方法测序需委托公司进行，价较昂贵，且测序周期长，影响研究进展。
[0004]因此，提供一种快速筛选高活性基因组编辑gRNA靶位点的方法是本领域技术人员亟需解决的问题。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，本专利技术提供了一种快速筛选高活性基因组编辑gRNA靶位点的方法。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0007]一种快速筛选CRISPR
‑
Cas9基因组编辑gRNA靶位点的方法，包括以下步骤：
[0008](1)在靶标基因的不同位置设计N个靶点，分别构建基因组编辑载体和LUC融合靶点的表达载体；
[0009](2)测试LUC融合靶点后载体中双荧光素酶能正常表达；
[0010](3)将N个靶点的基因组编辑载体与LUC融合靶点载体共表达原生质体，利用双荧光素酶报告系统测定原生质体LUC和REN的活性，比较N个靶点LUC/REN的比值，确定最小比值者为最佳靶点。
[0011]将不同靶点的基因组编辑载体与LUC融合靶点载体共表达原生质体后，由于基因组编辑载体的表达，会在LUC融合靶点载体中相应的靶点位置产生插入或缺失突变，使LUC
编码框移码，从而产生无活性的LUC蛋白，进一步使检测的LUC活性下降，降低LUC/REN的比值。
[0012]作为本专利技术优选的技术方案，N≥2。
[0013]对基因组进行编辑时，选择2个及以上靶点进行筛选，可快速定位编辑活性高的位点，进一步利用CRISPR
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Cas9基因组编辑技术，提高育种成功几率。
[0014]本专利技术的另一目的为提供上述快速筛选CRISPR
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Cas9基因组编辑gRNA靶位点的方法在基因组编辑中的应用。
[0015]经由上述的技术方案可知，本专利技术公开提供了一种快速筛选CRISPR
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Cas9基因组编辑gRNA靶位点的方法，与现有技术相比，本专利技术方法具有靶位点的选择不受限制性内切酶位点的限制，可选择性广，且成本低，能够快速筛选出基因编辑活性高的靶位点进行下一步CRISPR
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Cas9基因组编辑工作。
附图说明
[0016]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
[0017]图1附图为香蕉PDS基因结构及靶位点示意图；
[0018]图2附图为CRISPR/Cas9基因组编辑载体示意图；
[0019]图3附图为LUC融合靶点活性检测结果示意图；
[0020]图4附图为不同靶位点gRNA活性鉴定双荧光素酶报告系统示意图；
[0021]图5附图为不同靶位点基因组编辑活性LUC/REN结果示意图；
[0022]图6附图为高通量测序扩增示意图；
[0023]图7附图为不同靶位点高通量测序法基因组编辑效率分析示意图。
具体实施方式
[0024]下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0025]实施例1
[0026]构建LUC融合靶点的表达载体和基因组编辑载体。
[0027]1.以香蕉白化基因PDS为靶标基因，分别选取MaPDS基因的第二和第七个外显子上的5
′‑
CATCTTTCTGCAATGGTCCACGG
‑3′
(SEQ ID NO：1)和5
′‑
CCGGACCGAGTCAATGATGAAGT
‑3′
(SEQ ID NO：2)为靶标位点，记为T1和T2(如附图1所示)。
[0028]2.以pGreenⅡ0800
‑
LUC载体为基础，针对不同靶位点T1和T2，构建靶点融合荧光素酶的LUC表达载体。
[0029](1)以pGreenⅡ0800
‑
LUC载体上的35S启动子为模板，设计引物扩增35S启动子。
[0030]PCR扩增长条件为：95℃3min；95℃5S,56℃15S,72℃30S35个循环，72℃5min。
[0031]PCR反应体系为：
[0032][0033]两对引物如下(在下游引物中引入含有香蕉PDS基因靶点的序列)：
[0034]F1:5
′‑
GTGGAGATCGAATTCCCATGGTGAGACTTTTCAACAAAGG
‑3′
(SEQ ID NO：3)；
[0035]R1:5
′‑
TATGTTTTTGGCGTCTTCGCCGTGGACCATTGCAGAAAGA本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种快速筛选CRISPR
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Cas9基因组编辑gRNA靶位点的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)在靶标基因的不同位置设计N个靶点，分别构建基因组编辑载体和LUC融合靶点的表达载体；(2)测试LUC融合靶点后载体中双荧光素酶能正常表达；(3)将N个靶点的基因组编辑载体与LUC融合靶点载体共表达原生质体，利用双荧光素酶报告系统...

【专利技术属性】
技术研发人员：毕方铖，张森，吴少平，胡春华，窦同心，易干军，
申请(专利权)人：广东省农业科学院果树研究所，
类型：发明
国别省市：