一种检测许氏平鲉SOCS1对ISRE活性影响的方法技术

本发明专利技术公开了一种检测许氏平鲉SOCS1对ISRE活性影响的方法，包括以下步骤：提取带有许氏平鲉SOCS1基因的重组质粒；培养HEK293T细胞，待培养细胞密度达到45

【技术实现步骤摘要】
一种检测许氏平鲉SOCS1对ISRE活性影响的方法


[0001]本专利技术涉及细胞生物学
，特别涉及一种检测许氏平鲉SOCS1对ISRE活性影响的方法。

技术介绍

[0002]许氏平鲉又名黑鲪(Sebastes schlegelii)属鲉形目、杜父鱼亚目、鲪科。广泛分布于我国渤海、黄海和东海近海岩礁地带，日本、朝鲜沿岸也均有分布，为冷水性近海底层肉食性鱼类，生长适温1
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27℃，最适生长温度4
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25℃，适盐28
‰‑
33.4
‰
。黑鲪属凶猛肉食性，主要摄食杂鱼和虾，对头足类和贝类的摄食量也较大。由于海洋资源日益枯竭，其经济价值逐年升高，因此合理开发利用许氏平鲉资源，保持其资源的可持续利用已势在必行。所以，许氏平鲉的人工育苗或成鱼养殖已经在我国逐步进行。但是人工育苗或成鱼养殖过程中容易遭受各种原生动物或病等病害菌的影响，给养殖带来很大的困扰与经济损失。细胞因子（Cytokines, CK）是由多种活化的免疫细胞以及其他细胞产生的多肽分子，能够广泛的调节细胞。因此细胞因子在机体的免疫调节和维持生物稳定方面发挥着重要的作用。过量的细胞因子或其信号转导紊乱可引起多种疾病，例如过敏性疾病、自身免疫性疾病、炎症性疾病、生殖性疾病和癌症。但这种情况并不会经常发生，因为机体为了防止过度的免疫给其造成伤害，会严格控制细胞因子的作用强度、空间与时间。细胞因子信号转导抑制蛋白（Suppressor of cytokine signaling, SOCS）是一类重要的细胞因子信号通路抑制剂。多种细胞因子可以诱导SOCS的生成，生成的SOCS并对细胞因子信号通路产生负调控作用，对细胞因子的激活、连续周期和信号强度有着反向调控的功能，在维持稳态和正常细胞功能中发挥重要作用。SOCS蛋白在哺乳动物和鱼类中均能找到，但鱼类中发现的SOCS家族成员要比哺乳动物多4种，其中哺乳动物细胞中的SOCS1
‑
7和CISH与鱼类中的同源。SOCS1能够被许多的细胞因子诱导激活，例如 JNK、NF
‑
кB和 p38，它对于细胞的免疫调控有比较广泛的负调控机制，尤其是对IFN类刺激物诱导的细胞转染更为敏感，负调控机制更加灵敏，例如IFN
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α、IFN
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β、IFN
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γ。所以，专利技术人认为，研究许氏平鲉SOCS1具有重大意义，以期为许氏平鲉的免疫防御机制研究提供基础资料。

技术实现思路

[0003]本专利技术为了解决上述技术问题，提供了一种检测许氏平鲉SOCS1对ISRE活性影响的方法。本专利技术是采用以下技术方案得以实现的。一种检测许氏平鲉SOCS1对ISRE活性影响的方法，包括以下步骤：S1.提取带有许氏平鲉SOCS1基因的重组质粒；S2.培养HEK293T细胞，待培养细胞密度达到45
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55%时进行铺板；S3.将步骤S1带有SOCS1基因的重组质粒以及荧光素酶报告基因质粒转染步骤S2的细胞；
S4.转染12
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14h后，加入细胞因子刺激细胞，继续培养12
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16h后，进行荧光倒置显微镜或测定荧光强度。进一步的，步骤S1中，带有SOCS1基因的重组质粒选用pEGFP
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C1
‑
Ss
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SOCS1a质粒或pEGFP
‑
C1
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Ss
‑
SOCS1b质粒。进一步的，步骤S3中，荧光素酶报告基因质粒为ISRE质粒和pRL
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TK质粒。进一步的，步骤S4中，细胞因子选用poly（I:C）或IFN
‑
γ。进一步的，步骤S4中，测定荧光强度的方法为：将细胞裂解液与萤火虫荧光素检测试剂混合液加入到细胞中，孵育15
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20min，测定萤火虫发光强度数据；再取Dual
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Glo Stop & Glo Buffer加入到细胞中，孵育15
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20min，测定海肾发光强度数据。本申请具有以下有益效果。本申请分别将目的基因质粒（SsSOCS1a、SsSOCS1b）、ISRE报告基因质粒、pRL
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TK质粒，对照质粒pEGFP
‑
C1，通过脂质体转染试剂瞬时转染到HEK293T细胞内，荧光倒置显微镜观察转染效果，通过多功能酶标仪检测双荧光素酶，从而检测了许氏平鲉SOCS1对ISRE活性影响。本申请通过双荧光素酶基因报告系统检测了许氏鲆鮋SOCS1（SsSOCS1）对于ISRE活性的影响，为后续的许氏鲆鮋SOCS1功能研究提供了基础资料，也为许氏平鲉的人工育苗或成鱼养殖奠定了理论和实验基础。
附图说明
[0004]图1是本申请提取5种质粒的琼脂糖凝胶电泳图（M: DNA 2000 Maker； 1：ISRE； 2：pEGFP
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C1； 3：SOCS1a； 4：SOCS1b；5：pRL
‑
TK）；图2是本申请poly（I:C）对照组荧光倒置显微镜下的荧光图；图3是本申请poly（I:C）SsSOCS1a实验组荧光倒置显微镜下的荧光图；图4是本申请poly(I:C）SsSOCS1b实验组荧光倒置显微镜下的荧光图；图5是本申请IFN
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γ对照组荧光倒置显微镜下的荧光图；图6是本申请IFN
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γ SsSOCS1a实验组荧光倒置显微镜下的荧光图；图7是本申请IFN
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γ SsSOCS1b实验组荧光倒置显微镜下的荧光图；图8是本申请poly（I:C）刺激下转染不同质粒细胞的相对荧光强度图；图9是本申请IFN
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γ刺激下转染不同质粒细胞的相对荧光强度图。
具体实施方式
[0005]下面结合附图和实施例对专利技术进行进一步的说明。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 实验细菌、细胞和质粒实验所用菌：大肠杆菌，存放于
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80℃冰箱中。实验所用细胞：使用HEK293T细胞，培养于细胞房培养箱中。实验所用质粒：pEGFP
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C1、ISRE、pRL
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TK购自上海碧云天生物技术有限公司；pEGFP
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C1
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Ss
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SOCS1a、pEGFP
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C1
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Ss
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SOCS1b购自武汉淼灵生物科技有限公司。1.1.2 实验仪器与设备
恒温箱、培养瓶、传代室超净工作台、光学显微镜、荧光倒置显微镜、多功能酶标仪、超微量核酸蛋白测定仪（NanoDrop）、电泳仪、核酸凝胶观察仪、质粒提取试剂盒中相关仪器、1.5 ml离心管、0.2 ml离心管、培养板、各类型移液枪若干。1.1.3 实验试剂双抗、PBS胎牛血清、基本培养基、胰酶消化液、质粒提取试剂盒中相关试剂、xfect转染试剂、质粒本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测许氏平鲉SOCS1对ISRE活性影响的方法，其特征在于：包括以下步骤：S1.提取带有许氏平鲉SOCS1基因的重组质粒；S2.培养HEK293T细胞，待培养细胞密度达到45
‑
55％时进行铺板；S3.将步骤S1带有SOCS1基因的重组质粒以及荧光素酶报告基因质粒转染步骤S2的细胞；S4.转染12
‑
14h后，加入细胞因子刺激细胞，继续培养12
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16h后，进行荧光倒置显微镜或测定荧光强度。2.根据权利要求1所述的一种检测许氏平鲉SOCS1对ISRE活性影响的方法，其特征在于：步骤S1中，带有SOCS1基因的重组质粒选用pEGFP
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C1
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Ss
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SOCS1a质粒或pEGFP
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C1
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Ss
‑...

【专利技术属性】
技术研发人员：王光花，张敏，
申请(专利权)人：青岛农业大学，
类型：发明
国别省市：