SARS-CoV-2冠状病毒3C蛋白酶活性抑制剂的筛选方法及筛选试剂盒技术

本发明专利技术公开一种SARS-CoV-2冠状病毒3C蛋白酶活性抑制剂的筛选方法及筛选试剂盒。提供的3C蛋白酶活性抑制剂的筛选方法通过构建一个可以测定3C蛋白酶活性的体系以及表达具有较高活性的3C蛋白酶的载体，能够在细胞水平对病毒3C蛋白酶活性的抑制剂进行筛选，可以用于抗病毒的药物的开发。抗病毒的药物的开发。抗病毒的药物的开发。

【技术实现步骤摘要】
SARS-CoV-2冠状病毒3C蛋白酶活性抑制剂的筛选方法及筛选试剂盒


[0001]本专利技术属于分子和细胞生物学领域，具体涉及一种病毒3C蛋白酶活性抑制剂的筛选方法及筛选试剂盒，尤其涉及一种SARS-CoV-2冠状病毒3C蛋白酶活性抑制剂的筛选方法及筛选试剂盒。

技术介绍

[0002]新型冠状病毒SARS-CoV-2是2019年发现的第7种可以感染人的冠状病毒，于2020年1月12日被世界卫生组织命名，其可以引发新型冠状病毒肺炎COVID-19，对人类的身体健康产生严重的威胁。
[0003]SARS-COV-2冠状病毒与2003年“非典”SARS冠状病毒(SARS-CoV)和“中东呼吸综合征”MERS冠状病毒(MERS-CoV)一样，同属于单正链RNA病毒。通过基因序列比对，SARS-COV-2与SARS-CoV有约80％相似性，与MERS-CoV有40％的相似性。SARS-COV-2冠状病毒传染性强，对人类健康是一个重大的潜在威胁，因此寻找抗SARS-COV-2冠状病毒的药物势在必行。
[0004]3C蛋白酶又称为3CL蛋白酶或M蛋白酶，在单正链RNA病毒的蛋白成熟过程中发挥着重要作用，其能够识别特异的酶切位点，剪切病毒的多聚蛋白，将其剪切为多个有活性的蛋白，最终组装为新的病毒颗粒。因此，抑制3C蛋白酶的催化功能可有效抑制病毒前体蛋白的切割、阻断病毒的复制，起到抗单正链RNA病毒的作用。通过筛选能够抑制3C蛋白酶活性的抑制剂已经成为当前开发抗单正链RNA病毒的药物的重要途径，因此，针对一种新发现的单正链RNA病毒-SARS-COV-2冠状病毒，在体外建立用于筛选其3C蛋白酶活性的抑制剂的方法对于抗SARS-COV-2冠状病毒药物的开发具有重要的临床意义。

技术实现思路

[0005]针对现有技术中存在的问题的一个或多个，本专利技术的一个方面提供一种病毒3C蛋白酶活性抑制剂的筛选方法，其包括：
[0006]将表达具有活性的病毒3C蛋白酶的表达载体、表达病毒3C蛋白酶的底物的表达载体与候选试剂在细胞中共孵育作为实验组，同时设置不添加候选试剂的阴性对照，根据实验组相对于阴性对照的荧光信号强度的变化来筛选病毒3C蛋白酶活性抑制剂；
[0007]其中所述病毒3C蛋白酶的底物为IL1β蛋白和Gussia荧光素酶通过病毒3C蛋白酶的酶切位点连接而成的融合蛋白。
[0008]上述病毒3C蛋白酶为SARS-CoV-2冠状病毒3C蛋白酶。
[0009]上述表达具有活性的病毒3C蛋白酶的表达载体的构建方法包括：
[0010]A)在SARS-COV-2冠状病毒3C蛋白酶的核苷酸序列的5
’
和3
’
端分别连接SARS-COV-2冠状病毒的NSP7和NSP8序列，且在各连接处插入SARS-COV-2冠状病毒3C蛋白酶的酶切位点，获得SARS-COV-2冠状病毒3C蛋白酶重组表达序列；
[0011]B)将步骤A)的3C蛋白酶重组表达序列克隆至真核表达载体，获得表达具有活性的
病毒3C蛋白酶的表达载体。
[0012]上述表达病毒3C蛋白酶的底物的表达载体的构建方法包括：
[0013]a)将IL1β蛋白表达序列和Gussia荧光素酶表达序列通过SARS-COV-2冠状病毒3C蛋白酶的酶切位点连接，获得融合表达序列；
[0014]b)将步骤a)的融合表达序列克隆至真核表达载体，获得表达病毒3C蛋白酶的底物的表达载体。
[0015]上述荧光信号强度的变化为荧光信号强度的降低。
[0016]用于上述的方法的表达具有活性的SARS-COV-2冠状病毒3C蛋白酶的表达载体也属于本专利技术的内容；任选地，所述表达具有活性的SARS-COV-2冠状病毒3C蛋白酶的表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示。
[0017]用于上述的方法的表达SARS-COV-2冠状病毒3C蛋白酶的底物的表达载体也属于本专利技术的内容；任选地，所述表达SARS-COV-2冠状病毒3C蛋白酶的底物的表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
[0018]本专利技术的另一方面提供一种用于筛选SARS-CoV-2冠状病毒3C蛋白酶活性抑制剂的试剂盒，其包括上述的表达具有活性的SARS-CoV-2冠状病毒3C蛋白酶的表达载体，和上述的表达SARS-CoV-2冠状病毒3C蛋白酶的底物的表达载体。
[0019]本专利技术另一方面还提供一种病毒3C蛋白酶活性的测定方法，其包括以下步骤：
[0020]1)将IL1β蛋白表达序列和Gussia荧光素酶表达序列通过病毒3C蛋白酶的酶切位点连接，获得融合表达序列；
[0021]2)将步骤1)的融合表达序列克隆至真核表达载体，获得表达载体；
[0022]3)将步骤2)的表达载体与病毒3C蛋白酶的表达体系在细胞中进行共表达，通过测定共表达体系的荧光信号强度来表征病毒3C蛋白酶的活性；
[0023]任选地，步骤3)中所述病毒3C蛋白酶的表达体系为将病毒3C蛋白酶的表达序列克隆至真核表达载体所构建的病毒3C蛋白酶的表达载体。
[0024]上述病毒3C蛋白酶为单正链RNA病毒的3C蛋白酶，优选为SARS-CoV-2冠状病毒3C蛋白酶。
[0025]本专利技术再一方面还提供一种测定SARS-CoV-2冠状病毒3C蛋白酶活性的试剂盒，其包括上述的表达SARS-CoV-2冠状病毒3C蛋白酶的底物的表达载体；任选地，所述表达SARS-CoV-2冠状病毒3C蛋白酶的底物的表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
[0026]基于以上技术方案提供的SARS-COV-2冠状病毒3C蛋白酶活性抑制剂的筛选方法通过建立表达具有活性的SARS-COV-2冠状病毒3C蛋白酶的体系，并构建一个基于3C蛋白酶酶切进而激活荧光素酶活性的报告体系，能够在细胞水平对SARS-COV-2冠状病毒3C蛋白酶活性进行评价，进而可以利用该评价体系对SARS-COV-2冠状病毒3C蛋白酶活性的抑制剂进行筛选。基于提供的筛选方法还提供了用于筛选SARS-COV-2冠状病毒3C蛋白酶活性抑制剂的试剂盒，可以快速筛选出能够抑制SARS-COV-2冠状病毒3C蛋白酶活性的抑制剂，能够有效用于抗SARS-COV-2冠状病毒的药物的开发。
附图说明
[0027]图1为SARS-CoV-2冠状病毒3C蛋白酶活性测定体系的构建原理图；
[0028]图2为表达载体S1的质粒图谱；
[0029]图3为表达载体C1的质粒图谱；
[0030]图4为表达载体C1和表达载体C2表达的3C蛋白酶的活性对比柱状图；
[0031]图5为候选化合物和阳性药物对3C蛋白酶活性的抑制效果图；
[0032]图6为羟氯喹对SARS-CoV-2冠状病毒3C蛋白酶活性的抑制曲线。
具体实施方式
[0033]本专利技术旨在提供一种病毒3C蛋白酶活性抑制剂的筛选方法，尤其是提供一种SA本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.病毒3C蛋白酶活性抑制剂的筛选方法，其包括：将表达具有活性的病毒3C蛋白酶的表达载体、表达病毒3C蛋白酶的底物的表达载体与候选试剂在细胞中共孵育作为实验组，同时设置不添加候选试剂的阴性对照，根据实验组相对于阴性对照的荧光信号强度的变化来筛选病毒3C蛋白酶活性抑制剂；其中所述病毒3C蛋白酶的底物为IL1β蛋白和Gussia荧光素酶通过病毒3C蛋白酶的酶切位点连接而成的融合蛋白。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述病毒3C蛋白酶为SARS-CoV-2冠状病毒3C蛋白酶。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述表达具有活性的病毒3C蛋白酶的表达载体的构建方法包括：A)在SARS-COV-2冠状病毒3C蛋白酶的核苷酸序列的5
’
和3
’
端分别连接SARS-COV-2冠状病毒的NSP7和NSP8序列，且在各连接处插入SARS-COV-2冠状病毒3C蛋白酶的酶切位点，获得SARS-COV-2冠状病毒3C蛋白酶重组表达序列；B)将步骤A)的3C蛋白酶重组表达序列克隆至真核表达载体，获得表达具有活性的病毒3C蛋白酶的表达载体。4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述表达病毒3C蛋白酶的底物的表达载体的构建方法包括：a)将IL1β蛋白表达序列和Gussia荧光素酶表达序列通过SARS-COV-2冠状病毒3C蛋白酶的酶切位点连接，获得融合表达序列；b)将步骤a)的融合表达序列克隆至真核表达载体，获得表达病毒3C蛋白酶的底物的表达载体。5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述荧光信号强度的变化为荧光信号强度的降低。6.用于权利要求2-5中任一项所述的方法的表达具有活性的SARS-COV-2冠状...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘青松，胡晨，王文超，任涛，王伟，王黎，陈先涛，
申请(专利权)人：合肥中科普瑞昇生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：