新冠病毒包膜蛋白中和抗体活性评价方法技术

本申请提供了一种新冠病毒中和抗体活性非诊断评价方法，其中使用了基于HIV/Lu c报告载体的假病毒以及跨膜丝氨酸蛋白酶瞬时转染的稳定表达人ACE2(hACE2)受体的细胞。本发明专利技术还提供了相应假病毒产品在评价新冠病毒疫苗效果中的应用。效果中的应用。效果中的应用。

【技术实现步骤摘要】
新冠病毒包膜蛋白中和抗体活性评价方法


[0001]本申请属于蛋白、疫苗和微生物领域。具体地，本申请提供了一种新冠病毒包膜蛋白中和抗体活性评价方法。

技术介绍

[0002]SARS
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CoV
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2的S蛋白介导病毒吸附和侵入细胞的过程，是诱导中和抗体的主要抗原。目前被广泛应用于评估患者体内或者疫苗接种人群接种后产生的保护性免疫应答程度的方法包括ELISA等技术在内的免疫学检测方法,检测的靶标主要是针对S蛋白特定区域的结合抗体而非真正具有阻止病毒侵染活性的中和抗体，因此难以真实评价抗体对病毒的中和作用以及对宿主的保护效果。评估SARS
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CoV
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2疫苗诱导的中和抗体的最直接的方法是使用活病毒的感染中和试验或空斑减数试验，但是活病毒的操作必须在BSL
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3实验室中进行，受实验条件和病毒来源等因素的限制。另外,由于活病毒在扩增和传代过程中易发生基因突变且培养条件和结果判读标准的不同，不同实验室的活病毒检测结果常常存在较大差异。在目前病毒变异频繁，各种疫苗集中启用的情况下，急需寻找一种准确检测中和抗体活性的方法。

技术实现思路

[0003]为了解决SARS
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CoV
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2活病毒应用于相关分析试验中存在种种局限问题，本研究建立了一种基于HIV/Luc报告载体的假病毒检测系统用于SARS
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CoV
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2中和抗体的检测和定量分析，操作相对安全，检测结果更加稳定。将经过密码子优化的且C末端缺失19个氨基酸的S蛋白插入假病毒颗粒中，假病毒将以与活病毒相同的方式进入细胞。本研究中构建的假病毒可用于评价所有类型的中和抗体以及针对S蛋白设计的小分子药物在阻止病毒进入细胞方面的效果。本研究通过将HIV骨架质粒与S蛋白表达质粒共转染293T细胞制备假病毒，同时用跨膜丝氨酸蛋白酶(TMPRSS2)瞬时转染的hACE2受体稳定表达T
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REx 293细胞作为靶细胞评价假病毒进入的水平。TMPRSS2是一种可切割ACE2和刺突蛋白的细胞表面蛋白酶，在病毒入侵过程中可对冠状病毒的刺突蛋白预激活，为SARS
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CoV
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2进入细胞提供便利。本研究中构建的假病毒带有荧光素酶报告基因，可以通过荧光测定仪精确地检测报告基因的表达,实现病毒的定量检测。通过替换S蛋白表达质粒，可以研究抗S蛋白抗体针对不同突变株的交叉中和作用。该假病毒检测系统除了用于评估中和抗体效价和病毒进入抑制剂在阻断病毒入侵细胞过程中的效果外，它还可以用于研究病毒的组织嗜性和受体识别方式。
[0004]新冠病毒包膜蛋白中和抗体活性评价技术的实现包括：1.hACE2受体诱导表达靶细胞T
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REx 293
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hACE2的构建；2.通过在靶细胞T
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REx 293
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hACE2中同时表达TMPRSS2，对SARS
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CoV
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2假病毒预激活从而提高其感染量；3.基于HIV骨架的表达新冠病毒包膜蛋白假病毒单轮感染系统建立。
[0005]一方面，本申请提供了一种新冠病毒中和抗体活性非诊断评价方法，其中使用了基于HIV骨架的表达新冠病毒包膜蛋白突变体的假病毒。
[0006]进一步地，所述基于HIV骨架的表达新冠病毒包膜蛋白突变体的假病毒是通过将HIV/Luc骨架质粒与S蛋白或S蛋白突变体表达质粒共转染来制备的。
[0007]进一步地，共转染的对象为293T细胞。
[0008]进一步地，所述HIV/Luc骨架质粒为pNL4
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3.Luc.R
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E
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。
[0009]进一步地，所述方法中还使用了稳定表达hACE2受体的T
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REx 293细胞作为靶细胞。
[0010]进一步地，所述靶细胞以跨膜丝氨酸蛋白酶瞬时转染。
[0011]另一方面，本申请提供了一种基于HIV骨架的表达新冠病毒包膜蛋白突变体的假病毒在评价新冠病毒疫苗效果中的应用。
[0012]进一步地，所述基于HIV骨架的表达新冠病毒包膜蛋白突变体的假病毒是通过将HIV/Luc骨架质粒与不同S蛋白突变体表达质粒共转染293T细胞来制备的。
[0013]进一步地，所述HIV/Luc骨架质粒为pNL4
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3.Luc.R
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E
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。
[0014]另一方面，本申请提供了上述假病毒在制备新冠病毒疫苗效果试剂组中的应用。
[0015]本申请的方法和假病毒可用于诊断或非诊断用途，优选地，用于新冠病毒相关科学研究特别是疫苗研究，疾控数据统计和研判等非诊断用途。
[0016]本申请中的抗体可以为各种疫苗，包括但不限于灭活疫苗、重组蛋白/亚单位疫苗、腺病毒载体疫苗、RNA疫苗等；pNL4
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3.Luc.R
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E
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有市售产品，也可以根据相关文献构建。
[0017]本申请的基于假病毒侵染平台的新冠病毒中和抗体检测系统，具有安全性高，检测结果稳定性好，可重复性佳的优势,可通过将病毒与抗体共同孵育后加至表达hACE2+TMPRSS2的T
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REx 293细胞中，培养48h后，通过检测荧光素酶报告基因的表达来评价抗体或者小分子抑制剂对病毒侵入宿主细胞的保护作用，用于评估中和抗体效价和病毒进入抑制剂在阻断病毒入侵细胞过程中的效果及病毒的组织嗜性和受体识别方式等机制研究。
附图说明
[0018]图1为HIV/Luc报告基因结构及基于HIV/Luc报告载体的假病毒包装示意图；
[0019]图2为感染模型的建立与SARS
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CoV
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2病毒进入宿主细胞的检测：左图为表达hACE2受体+TMPRSS2的T
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REx 293靶细胞感染平台和病毒侵入系统构建示意图；右上为假病毒侵入实验(该假病毒系统带有EGFP报告基因，可用荧光显微镜检测)，Tet+表示加入四环素，Tet
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表示未加四环素，表达hACE2受体和TMPRSS2的T
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REx 293细胞可以有效支持SARS
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CoV和SARS
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CoV
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2假病毒的侵入，却不能支持MERS
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CoV假病毒侵入；右下为这三种假病毒侵入效率的直方图。
[0020]图3为CB6单克隆抗体中和检测结果。
具体实施方式
[0021]为让本领域的技术人员更加清晰直观地了解本专利技术，下面将结合附图，对本专利技术作进一步的说明。
[0022]实施例1hACE2受体诱导表达系统的建立和鉴定
[0023](1)SARS
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CoV<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种新冠病毒中和抗体活性非诊断评价方法，其特征在于，其中使用了基于HIV骨架的表达新冠病毒包膜蛋白突变体的假病毒。2.根据权利要求1所述的评价方法，其特征在于，其中所述基于HIV骨架的表达新冠病毒包膜蛋白突变体的假病毒是通过将HIV/Luc骨架质粒与S蛋白或S蛋白突变体表达质粒共转染来制备的。3.根据权利要求2所述的评价方法，其特征在于，其中所述共转染的对象为293T细胞。4.根据权利要求2或3所述的评价方法，其特征在于，其中所述HIV/Luc骨架质粒为pNL4
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3.Luc.R
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E
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。5.根据权利要求1
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4任一项所述的评价方法，其特征在于，其中还使用了稳定表达hACE2受体的T...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈丹瑛，赵学森，李星霖，郑梅，刘永梅，邱雅若，李国力，
申请(专利权)人：首都医科大学附属北京地坛医院，
类型：发明
国别省市：