质谱分析校准物制造技术

本发明专利技术提供了定量来自对象的样品中κ或λ免疫球蛋白轻链的量的方法，其包括：i.提供来自对象的样品；ii.将所述样品与预定量的λ轻链校准物或κ轻链校准物混合以形成混合物；iii.对所述混合物进行质谱分析；以及iv.定量以下中的一种或两种：a)通过将通过质谱分析测定的所述混合物中λ轻链的相对量与通过质谱分析测定的所述混合物中校准物κ轻链的相对量进行比较，定量所述样品中λ轻链的量；和/或b)通过将通过质谱分析测定的所述混合物中κ轻链的相对量与通过质谱分析，最通常为MALDI

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】质谱分析校准物
[0001]本专利技术涉及κ轻链或λ轻链作为校准物以允许通过质谱分析定量样品中的相对λ或κ轻链的用途，以及涉及含有这种校准物的试剂盒。
[0002]抗体分子(也被称为免疫球蛋白)具有双重对称性，并且通常由两条相同的重链和两条相同的轻链组成，每条含有可变结构域和恒定结构域。重链和轻链的可变结构域结合形成抗原结合位点，使得两条链都有助于抗体分子的抗原结合特异性。抗体的基本四聚体结构包含通过二硫键共价连接的两条重链。每条重链转而又经由二硫键与轻链连接。这产生了基本上“Y”形的分子。
[0003]重链是在抗体中发现的两种类型的链中较大的链，与较小轻链(25,000Da)相比，具有50,000
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77,000Da的典型分子量。
[0004]重链有五个主要类别或类别，它们是γ、α、μ、δ和ε，它们分别是IgG、IgA、IgM、IgD和IgE的组成重链。IgG是正常人血清的主要免疫球蛋白，占总免疫球蛋白库的70
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75％。这是二级次免疫应答的主要抗体。它形成两条重链加上两条轻链的单一四聚体。
[0005]IgM占免疫球蛋白库的大约10％。该分子与J链一起形成五个基本4链结构的五聚体。单个重链具有大约65,000Da的分子量，并且整个分子具有约970,000Da的分子量。IgM主要限于血管内库，并且是主要的早期抗体。
[0006]IgA占人血清免疫球蛋白库的15
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20％。超过80％的IgA作为单体存在。然而，一些IgA(分泌性IgA)以二聚体形式存在。r/>[0007]IgD占总血浆免疫球蛋白的不到1％。在成熟B细胞的表面膜上发现了IgD。
[0008]尽管在正常血清中缺乏IgE，但在嗜碱性粒细胞和肥大细胞的表面膜上发现了IgE。它与变应性疾病(如哮喘和枯草热)相关。
[0009]除了这五个主要类别之外，IgG有四个亚类(IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)。另外有两个IgA亚类(IgA1和IgA2)。
[0010]有两种类型的轻链：Lambda(λ)和Kappa(κ)。在人类中产生的κ分子大约是λ分子的两倍，但是这在一些哺乳动物中是完全不同的。每条链在折叠成一个恒定结构域和一个可变结构域的单多肽链中含有大约220个氨基酸。浆细胞产生五种重链类型中的一种以及κ分子或λ分子。与重链合成相比，通常存在大约40％过量的游离轻链的产生。当轻链分子不与重链分子结合时，它们被称为“游离轻链分子”。κ链通常作为单体存在。λ轻链倾向于形成二聚体。
[0011]存在许多与抗体产生细胞相关的增殖性疾病。
[0012]在许多这样的增殖性疾病中，浆细胞增殖形成相同浆细胞的单克隆肿瘤。这导致产生大量相同的免疫球蛋白，并且被称为单克隆丙种球蛋白病。
[0013]疾病如骨髓瘤和原发性系统性淀粉样变性(AL淀粉样变性)分别占英国癌症死亡的大约1.5％和0.3％。多发性骨髓瘤是非霍奇金淋巴瘤后的第二种常见形式的血液恶性肿瘤。在高加索人群体中，发病率大约为每年百万分之40。通常，多发性骨髓瘤的诊断基于骨髓中过量的单克隆浆细胞、血清或尿液中的单克隆免疫球蛋白以及相关器官或组织损伤(如高钙血症、肾机能不全、贫血或骨骼病变)的存在。骨髓的正常浆细胞含量为约1％，而在
多发性骨髓瘤中，该含量通常大于10％，经常大于30％，但可以大于90％。
[0014]AL淀粉样变性是一种蛋白质构象疾病，其特征在于单克隆游离轻链片段积聚成为淀粉样蛋白沉积物。通常，这些患者存在心脏或肾衰竭，但也可能涉及外周神经和其它器官。
[0015]可以通过患者的血流或甚至尿液中单克隆免疫球蛋白的存在来鉴定许多其它疾病。这些包括浆细胞瘤和髓外浆细胞瘤(在骨髓外出现并可在任何器官中发生的浆细胞肿瘤)。当存在时，单克隆蛋白通常是IgA。多发性孤立性浆细胞瘤可以在有或没有多发性骨髓瘤证据的情况下发生。瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症( macroglobulinaemia)是与单克隆IgM的产生相关的低级淋巴组织增生性疾病。在美国每年有大约1,500个新病例，在英国每年有大约300个新病例。血清IgM定量对于诊断和监测都是重要的。在英国，B细胞非霍奇金淋巴瘤引起所有癌症死亡的大约2.6％，并且已经使用标准电泳方法在约10
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15％的患者的血清中鉴定了单克隆免疫球蛋白。最初的报道表明，在60
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70％患者的尿液中可以检测到单克隆游离轻链。在B细胞中，已经通过游离轻链免疫测定鉴定了慢性淋巴细胞性白血病单克隆蛋白。
[0016]另外，存在所谓的MGUS病况。这些是意义未明的单克隆丙种球蛋白病。该术语表示在没有多发性骨髓瘤、AL淀粉样变性、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症等证据的个体中意外存在单克隆完整免疫球蛋白。MGUS可能会在50岁以上人群中占1％，70岁以上人群中占3％，以及80岁以上人群中占多达10％。这些中的大多数与IgG或IgM相关，但很少与IgA相关或是双克隆的。尽管大多数患有MGUS的人死于无关疾病，但MGUS可能会转变成恶性单克隆丙种球蛋白病。
[0017]在至少一些上述疾病的情况下，所述疾病存在单克隆免疫球蛋白或游离轻链的异常浓度。当疾病产生浆细胞的异常复制时，这经常导致该类型的细胞产生更多的免疫球蛋白，因为该“单克隆”繁殖并在血液中出现。
[0018]免疫固定电泳使用针对免疫球蛋白分子的沉淀抗体。尽管这提高了检验的灵敏度，但由于沉淀抗体的存在，它不能用于定量单克隆免疫球蛋白。进行免疫固定电泳也是相当费力的，并且解释可能是困难的。毛细管区带电泳在许多临床实验室中用于血清蛋白分离，并且能够检测大多数单克隆免疫球蛋白。然而，当与免疫固定相比时，毛细管区带电泳不能检测5％样品中的单克隆蛋白。这些所谓的“假阴性”结果包括低浓度单克隆蛋白。
[0019]血清血浆电泳(SPE)是一种替代程序，其难以鉴定低于0.5g/L的蛋白质以及难以定量低于10g/L的蛋白质。
[0020]已经产生了总κ和λ测定。然而，总κ和总λ测定对于检测单克隆免疫球蛋白、游离轻链或单克隆游离轻链太不灵敏。这是由于干扰这种测定的多克隆结合轻链的高背景浓度。
[0021]已经开发了能够检测游离κ轻链和单独检测游离λ轻链的灵敏测定。该方法使用针对游离κ轻链或游离λ轻链的多克隆抗体。在WO97/17372中也讨论了产生这种抗体的可能性，作为许多不同的可能的特异性之一。该文献公开了使动物耐受以允许其产生比现有技术所能产生的更具特异性的所期望的抗体的方法。游离轻链测定使用抗体来结合游离λ轻链或游离κ轻链。通过浊度测定法或浑浊度测定法测定游离轻链的浓度。这涉及将测试样品添加到在反应容器或比色皿中含有适当抗体的溶液中。光束通过比色皿，并且随着抗原
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抗体反应的进行，通过比色皿的光随着不溶性免疫复合物的形成而被越来越多地散射。在浊
度测定法中，通过测量与入射光成一定角度的光强度来监测光散射，而在浑浊度测定法中，通过测量入射光束强度的降低来监测本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.定量来自对象的样品中κ或λ免疫球蛋白轻链的量的方法，其包括：i.提供来自对象的样品；ii.将所述样品与预定量的λ轻链校准物或κ轻链校准物混合以形成混合物；iii.对所述混合物进行质谱分析；以及iv.定量以下中的一种或两种：a)通过将通过所述质谱分析测定的所述混合物中λ轻链的相对量与通过质谱分析测定的所述混合物中校准物κ轻链的相对量进行比较，定量所述样品中λ轻链的量；和/或b)通过将通过质谱分析测定的所述混合物中κ轻链的相对量与通过质谱分析，最通常为MALDI
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TOF光谱法或液相色谱
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质谱法，测定的所述混合物中校准物λ轻链的相对量进行比较，定量所述样品中κ轻链的量。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述校准物是多克隆λ轻链或多克隆κ轻链。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述校准物是单克隆κ轻链或单克隆λ轻链。4.根据权利要求1至3所述的方法，其中所述样品中的κ或λ轻链免疫球蛋白与一条或多条免疫球蛋白重链结合。5.根据权利要求1至4所述的方法，其中在混合之前，所述校准物的λ轻链或κ轻链与一条或多条免疫球蛋白重链结合。6.根据权利要求1至3所述的方法，其中所述样品中的κ或λ轻链是游离的κ或λ轻链。7.根据权利要求1至6所述的方法，其中所述校准物中的λ轻链或κ轻链是游离的轻链。8.根据权利要求1至7所述的方法，其中所述校准物中的λ轻链或所述校准物中的κ轻链是质量改变的。9.根据权利要求8所述的方法，其中与所述样品中的λ轻链或κ轻链相比，所述校准物具有一个或多个另外的氨基酸，或者与聚乙二醇连接。10.根据权利要求1至9所述的方法，其中在进行质谱分析之前在至少一个纯化步骤中纯化所述混合物。11.根据权利要求1至10所述的方法，其中所述样品或混合物是免疫纯化的。12.根据权利要求11所述的方法，其中用抗重链类特异性抗体、抗总轻链型特异性抗体、抗游离轻链型特异性抗体或抗重链类
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轻链型特异性抗体或其片段免疫纯化所述样品或混合物。13.根据权利要求12所述的方法，其中所述抗体是抗IgG特异性的、抗IgA特异性的、抗IgD特异性的、抗IgM特异性的或抗IgE特异性的。...

【专利技术属性】
技术研发人员：斯蒂芬，
申请(专利权)人：结合点集团有限公司，
类型：发明
国别省市：