鉴定或表征受试者中的免疫应答的方法技术

本发明专利技术提供了一种鉴定或表征受试者中的免疫应答的方法，其包括：(a)使来自所述受试者的含有免疫球蛋白的样品与至少一种固定在支持物上的抗原接触；(b)将未结合的非抗原特异性免疫球蛋白从所述支持物上洗去，以留下结合到所述支持物上的抗原的抗原特异性免疫球蛋白；(c)任选地从所述支持物上的抗原洗脱所述抗原特异性免疫球蛋白；和(d)对所述抗原特异性免疫球蛋白进行质谱分析以鉴定两种或更多种不同的抗原特异性免疫球蛋白类别、亚类和/或轻链类型。或轻链类型。或轻链类型。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】鉴定或表征受试者中的免疫应答的方法
[0001]本专利技术提供了一种通过使用例如胰蛋白酶消化片段通过质谱来定量抗原特异性免疫球蛋白来鉴定和定量受试者中的免疫应答的方法。还提供了计算机实施的方法和在所述方法中使用的测定试剂盒。所述方法尤其可用于表征免疫应答，例如抗病毒，真菌和细菌感染，自身抗原和其它免疫应答，包括对候选疫苗的表征。
[0002]人免疫球蛋白含有通过二硫键结合在一起的两个相同的重链多肽和两个相同的轻链多肽。有两种不同的轻链同种型(κ和λ)和五种不同的重链同种型(IgG、IgA、IgM、IgD和IgE)。
[0003]IgG提供了大多数抗侵入病原体的基于抗体的免疫。
[0004]IgA倾向于存在于粘膜区域，例如肠道，呼吸道和泌尿生殖道，并且经常防止病原体的定殖。它也在唾液，泪液和母乳中发现。通常发现它是通过所谓的J链肽连接的二聚体。
[0005]IgM作为单体在B细胞的表面上表达并且作为五聚体以分泌形式表达，并在B细胞介导的(体液)免疫的早期阶段消除病原体。IgM的五聚体通过J链肽连接在一起。
[0006]IgD是这样的一种抗体，其构成约1％的未成熟B淋巴细胞的质膜中的蛋白质，并且构成约0.25％的血清免疫球蛋白。
[0007]IgE在哺乳动物中被发现并且经常参与对寄生虫(例如蠕虫)的免疫，并且还在对过敏原的多种类型的超敏反应中起作用。
[0008]IgG具有四个亚类，IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。根据铰链区的大小，链间二硫键的位置，恒定区的氨基酸序列和分子量来区分这些亚类。亚类在激活补体的能力和它们与Fc受体的结合方面也不同。
[0009]IgG1占主要亚类IgG的60
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65％，并且主要负责针对蛋白质和多肽抗原的胸腺介导的免疫应答(也称为T细胞介导的免疫应答)。它也参与补体级联的调理和活化。
[0010]IgG2占主要亚类的20
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25％，并且是针对碳水化合物和多糖抗原的普遍的免疫应答。在所有IgG同种型缺陷中，IgG2的缺陷是最常见的，并且与婴儿中的反复气道和呼吸道感染有关。
[0011]IgG3占总IgG的约5
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10％，并且在针对蛋白质或多肽抗原的免疫应答中起主要作用。
[0012]IgG4通常占少于总IgG的4％。IgG4主要不与多糖结合。在IgG4相关疾病(RD)中观察到升高的IgG4水平，这是具有特征性组织病理学表象的免疫介导和慢性纤维炎性病况。血清IgG4的定量包括在迄今可用的所有IgG4
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RD诊断指南中，包括1型自身免疫性胰腺炎(AIP)，它是IgG4
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RD的胰腺表现，尽管在所有IgG4
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RD患者中未观察到升高的IgG4。最近的研究表明，在患有由浸润IgG阳性浆细胞引起的硬化性胰腺炎，胆管炎和间质性肺炎的患者中发现了升高的IgG4血清水平。IgG4的精确作用仍然是未知的。
[0013]表1显示了人体IgG抗体同种型或亚类的比较。这包括不同亚类对不同抗原的应答的概述。其还包括它们的补体激活和与参与抗原识别的Fc受体结合的概述。后者位于例如B淋巴细胞，杀伤细胞，巨噬细胞，嗜中性粒细胞和肥大细胞的膜上。这种受体识别抗体的Fc片段。
[0014]IgA，其分泌形式(作为二聚体)也被称为sIgA，具有两个亚类，IgA1和IgA2。IgA是补体系统的不良激活剂，而仅微弱地调理。尽管IgA1在血清中占优势(约80％)，但IgA2在分泌物中的百分比高于血清中的百分比(约35％在分泌物中)。IgA1是血清中发现的主要IgA亚类，其中大多数淋巴组织具有大部分产生IgA1的细胞。在一种同种异型IgA2m(1)中，重链和轻链没有用二硫化物连接，而是用非共价键连接。在分泌性淋巴组织，例如肠相关淋巴组织中，IgA2产生的份额大于非分泌性淋巴器官，例如脾和外周淋巴结中的份额。多糖抗原比蛋白质抗原更倾向于诱导更多的IgA2。
[0015]在哺乳动物中还没有发现另外两种抗体同种型。IgY在鸟和爬行动物中发现的，并且与哺乳动物IgG有关。IgD在鲨鱼和鳐鱼中发现的，并且与哺乳动物IgD有关。
[0016]免疫球蛋白亚类激活补体和介导抗体细胞细胞毒性的能力的不同意味着被激活的免疫球蛋白类型和亚类的变化可以对免疫应答，例如对感染具有积极的或消极的影响。例如，IgG3与对抗一系列的细胞内细菌，寄生虫和病毒的增强的控制或保护有关。与其它IgG亚型相比，IgG3抗体是效应或功能的有效介质，包括增强的ADCC，调理吞噬作用，补体激活和中和。因此，认为未来基于抗体的治疗和疫苗应该基于增强的功能能力的特征考虑利用IgG3。研究糖基化模式和同种异型对IgG3功能的影响可以扩大我们对IgG3应答及其治疗潜力的理解。
[0017]IgG3仅包括小部分的IgG，并且直到最近几年仍相对研究较少。最近的研究强调了IgG3效应子功能对一系列病原体的重要性，并且已经提供了克服IgG3相关限制的方法，所述IgG3相关限制例如同种异型依赖性短抗体半衰期和过度的促炎性激活。因此，理解IgG3和其它免疫球蛋白亚类的分子和功能特性可以促进改进的基于抗体的免疫疗法以及对抗感染性疾病的免疫疗法和疫苗的发展。
[0018]对免疫球蛋白及其亚类的检测是本领域已知的。然而，散射测浑法和浊度测定法将测量总免疫球蛋白的量，而不是抗原特异性的量。用于抗原特异性的量的ELISA方法利用免疫球蛋白亚类特异性抗体进行检测。这些抗体对每一类或亚类具有不同的亲合力。因此，例如IgG亚类或IgA亚类测定之间的比较可能不准确。此外，它们将具有不同的校准曲线，并且除了相对较少的例外之外，还缺乏国际标准来测量对不同致病抗原的抗体应答，这意味着测定结果之间的比较是不可能的。由于观察到的明显的量的差异，这防止了在单一测定中不同类别、亚类或轻链类型之间的任何比率或比较的可能性。
[0019]Ladwig，P.M.等人，Clinical Chemistry(2014)，第16卷，第1080
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1088页讨论了使用质谱对IgG亚类的绝对定量。他们描述了血清与稳定同位素标记的内肽标准以及完整纯化的马IgG的组合。样品被变性，还原，烷基化并用肽酶如胰蛋白酶消化。他们然后通过LC
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MS/MS分析消化的血清的IgG亚类1
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4和总IgG。他们能够证明可以使用LC
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MS/MS定量总IgG和IgG亚类1、2、3和4。重链和轻链同种型的同种型分析也描述在WO 2015/154052中，全文并入本文。这描述了通过质谱(MS)检测这种同种型。
[0020]专利技术人已经认识到，使单一方法同时和定量地剖析抗体应答，例如在感染之前，期间或之后，将允许更好的临床干预。他们认识到，通过固相捕获富集抗原或疾病特异性抗体，然后通过质谱分析，允许进行样品的自动分析，而没有例如基于ELISA的测定的缺点。预期这将提高临床医生管理受试者对疾病的免疫应答的能力，并允许本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.鉴定或表征受试者中的免疫应答的方法，其包括：(a)使来自所述受试者的含有免疫球蛋白的样品与至少一种固定在支持物上的抗原接触；(b)将未结合的非抗原特异性免疫球蛋白从所述支持物上洗去，以留下结合到所述支持物上的抗原的抗原特异性免疫球蛋白；(c)任选地从所述支持物上的抗原洗脱所述抗原特异性免疫球蛋白；和(d)对所述抗原特异性免疫球蛋白进行质谱分析以鉴定两种或更多种不同的抗原特异性免疫球蛋白类别、亚类和/或轻链类型。2.根据权利要求1所述的方法，其中将所述样品与至少两种不同的抗原接触，其中每种抗原在不同的支持物上或在相同支持物的不同部分上。3.根据权利要求2所述的方法，其中将所述样品分成至少两个等分试样，并且将每个等分试样与结合到不同支持物上的不同抗原接触。4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述支持物选自顺磁珠粒和MALDI
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TOF靶。5.根据权利要求1
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4所述的方法，其中对消化的抗原特异性免疫球蛋白进行质谱分析之前，对所述抗原特异性免疫球蛋白的至少一部分进行蛋白水解消化。6.根据权利要求1
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4所述的方法，其中在对抗原特异性免疫球蛋白进行质谱分析之前，不对所述抗原特异性免疫球蛋白的至少一部分进行蛋白水解消化。7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中对分离的免疫球蛋白进行质谱分析之前，用至少一种还原剂和/或变性剂解离所述抗原特异性免疫球蛋白的至少一部分以分离与重链结合的轻链。8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中将所述不同抗原特异性免疫球蛋白类别、亚类和/或轻链类型中的两种或更多种的相对量彼此比较，或者测定样品中所述不同抗原特异性免疫球蛋白类别、亚类和/或轻链类型中的两种或更多种的每一种的量。9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中对样品中一种或多种不同的抗原特异性免疫球蛋白类别、亚类和/或轻链类型的量进行定量。10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述免疫球蛋白类别选自IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述免疫球蛋白亚类选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述免疫球蛋白轻链选自λ轻链和κ轻链。13.根据权利要求11所述的方法，其中测定所述样品中λ:κ轻链的相对量的比率。14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法另外包括鉴定以下的一种或多种；a)与IgA和/或IgM结合的J链和/或b)与IgM结合的CD5L。15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述样品中的免疫球蛋白在与结合到所述支持物的抗原接触之前被纯化或富集。16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中将剩余的免疫球蛋白与结合到所述支持物上的抗原接触之前，去除所述样品中的至少一部分IgG。
17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤(c)中，在那些具有较高抗原结合特异性的抗原特异性免疫球蛋白之前，将具有较低抗原结合特异性的抗原特异性免疫球蛋白从结合到所述支持物上的抗原上洗脱下来。18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗原或每种抗原是来自以下的抗原：病毒、细菌、古细菌、真菌、原生动物、蠕虫、自身免疫抗原、癌症抗原或能够在受试者中诱导过敏反应的抗原。19.根据权利要求16所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：斯蒂芬，
申请(专利权)人：结合点集团有限公司，
类型：发明
国别省市：