本文件涉及用于鉴定和/或定量来自生物样品的免疫球蛋白的材料和方法，其中在使用质谱进行电离和检测之前无需对免疫球蛋白进行预纯化。例如，在用含有酸和还原剂的水性缓冲液稀释含有单克隆免疫球蛋白的样品，然后将所述样品与α‑氰基‑4‑羟基肉桂酸基质(CHCA)混合之后，可以使用基质辅助激光解吸电离飞行时间(MALDI‑TOF)质谱观察来自单克隆免疫球蛋白的单克隆轻链。在另一个实例中，在用水稀释含有单克隆免疫球蛋白的样品，然后将所述样品与CHCA基质混合后，可以使用MALDI‑TOF质谱在样品中观察到完整的单克隆免疫球蛋白。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用质谱鉴定免疫球蛋白背景1.
本文件涉及用于鉴定和/或定量来自生物样品的免疫球蛋白的材料和方法，其中在使用质谱进行电离和检测之前无需对免疫球蛋白进行预纯化。例如，在用含有酸和还原剂的水性缓冲液稀释含有单克隆免疫球蛋白的样品，然后将所述样品与α-氰基-4-羟基肉桂酸基质(CHCA)混合之后，可以使用基质辅助激光解吸电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱观察来自单克隆免疫球蛋白的单克隆轻链。在另一个实例中，在用水稀释含有单克隆免疫球蛋白的样品，然后将所述样品与CHCA基质混合后，可以使用MALDI-TOF质谱在样品中观察到完整的单克隆免疫球蛋白。2.背景信息人免疫球蛋白含有通过二硫键结合在一起的两个相同的重链多肽和两个相同的轻链多肽。有两种不同的轻链同种型(κ和λ)和五种不同的重链同种型(IgG、IgA、IgM、IgD和IgE)。可以通过准确的分子量使用质谱仪来鉴定单克隆免疫球蛋白、多克隆免疫球蛋白以及来自单克隆免疫球蛋白或多克隆免疫球蛋白的轻链和/或重链的任何组合。通过质谱检测和监测免疫球蛋白是本领域众所周知的。例如，WO2015/154052A和WO2014/150170公开了在液相色谱和ESI-Q-TOF四极杆飞行时间质谱分析之前，使用Melon凝胶(MelonGel)从血清样品中富集免疫球蛋白。WO2015/154052A类似地用LC-ESI-Q-TOF质谱使用Melon凝胶纯化。BarnidgeD.R.等人(J.Neuroimmunology(2015),285,123-126)也描述了从血清样品中富集免疫球蛋白。然后在通过LC-MS分析之前，使用DTT(二硫苏糖醇)还原纯化的血清样品。Mills等人(Clin.Chem.(2016)62(10)1334-1344)描述了在MALDI-TOF之前使用针对重链恒定区或轻链恒定区的骆驼科动物源的纳米抗体来纯化抗体。这些实例表明，常规地，抗体在通过质谱分析之前被纯化或富集的。在质谱(M.S.)之前免疫球蛋白的复杂纯化或富集增加了研究样品中免疫球蛋白的时间。HortinG.L.和RemaleyA.T.(Clin.Geonomics(2006)103-114)描述了主要血浆蛋白和血清样品的质量测定。样本用含有10mmol/L乙酸铵和10g/L芥子酸(sinapinicacid)的40％丙烯腈/10％乙醇/50％水/0.1％三氟乙酸稀释。分析了多种纯化的蛋白质，其包括糖蛋白、转铁蛋白、免疫球蛋白G、载脂蛋白和甲状腺素运载蛋白。两个样本的稀释血清样品能够鉴定IgG、白蛋白、前白蛋白、转铁蛋白和载脂蛋白。该论文的结论是对于质量小于30,000的几种最丰富的蛋白质(即，排除例如质量为147,000的IgG)，可以以足够的精度和准确性进行质量测量，以允许检测化学修饰和序列修饰。该论文还指出，在没有分级的复杂混合物的分析中存在缺陷。首先，只能观察到最丰富的成分。其次，高蛋白和盐浓度通常抑制信号。观察到白蛋白干扰检测其它峰(m/z为30,000)的能力。该论文的结论是应使用IgG和白蛋白的选择性消耗。没有公开其它免疫球蛋白或实际上轻链的鉴定。存在许多与抗体产生细胞相关的增生性疾病。在许多此类增生性疾病中，浆细胞增殖形成相同浆细胞的单克隆肿瘤。这导致产生大量相同的免疫球蛋白，并且被称为单克隆丙种球蛋白病。诸如骨髓瘤和原发性系统性淀粉样变性(AL淀粉样变性)的疾病分别占英国癌症死亡的大约1.5％和0.3％。多发性骨髓瘤是非霍奇金淋巴瘤后的第二种最常见形式的血液恶性肿瘤。在高加索人群中，发病率大约为每年百万分之40。通常，多发性骨髓瘤的诊断基于骨髓中过量的单克隆浆细胞、血清或尿液中的单克隆免疫球蛋白以及相关器官或组织损伤(如高钙血症、肾功能不全、贫血或骨损伤)的存在。骨髓的正常浆细胞含量为约1％，而在多发性骨髓瘤中，该含量通常大于10％，经常大于30％，但可能超过90％。AL淀粉样变性是一种蛋白质构象病症，其特征在于作为淀粉样蛋白沉积物的单克隆游离轻链片段的积聚。通常，这些患者存在心脏或肾衰竭，但也可能涉及外周神经和其它器官。有许多其它疾病可以通过患者的血流或实际上尿中单克隆免疫球蛋白的存在来鉴定。这些包括浆细胞瘤和髓外浆细胞瘤(一种在骨髓外出现并可在任何器官中发生的浆细胞肿瘤)。当存在时，单克隆蛋白通常是IgA。多发性孤立性浆细胞瘤可以在有或没有多发性骨髓瘤证据的情况下发生。瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症是与单克隆IgM的产生相关的低度淋巴组织增生性病症。在美国每年有大约1,500例新病例，在英国每年有大约300例新病例。血清IgM定量对于诊断和监测都是重要的。在英国，B细胞非霍奇金淋巴瘤大约占所有癌症死亡的2.6％，并且已经使用标准电泳方法在约10-15％的患者的血清中鉴定了单克隆免疫球蛋白。最初的报道表明，在60-70％的患者的尿液中可以检测到单克隆游离轻链。在B细胞慢性淋巴细胞性白血病中，已通过游离轻链免疫测定法鉴定到单克隆蛋白。另外，存在所谓的MGUS病况。这些是具有不确定意义的单克隆丙种球蛋白病。该术语表示在没有多发性骨髓瘤、AL淀粉样变性、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症等证据的个体中意外存在单克隆完整免疫球蛋白。MGUS可能在50岁以上人群中占1％，在70岁以上人群中占3％，并且在80岁以上的人群中高达10％。其中大多数是IgG或IgM相关的，但很少是IgA相关或双克隆的。尽管大多数患有MGUS的人死于无关疾病，但MGUS可能会转变为恶性单克隆丙种球蛋白病。对于上述疾病，至少在一些情况下，疾病表现出异常浓度的单克隆免疫球蛋白或游离轻链。当疾病产生浆细胞的异常复制时，这经常导致该类型细胞产生更多的免疫球蛋白，因为该“单克隆”繁殖并在血液中出现。概述本文件涉及用于鉴定和/或定量来自生物样品的免疫球蛋白的材料和方法，其中在使用质谱进行电离和检测之前无需对免疫球蛋白进行预纯化。在一些情况下，质谱技术可以被用于鉴定和/或定量生物样品中的免疫球蛋白，而不需要通过免疫纯化或从样品中去除其它非免疫球蛋白蛋白来额外纯化免疫球蛋白。如本文所证明的，单克隆免疫球蛋白或多克隆免疫球蛋白、以及来自单克隆免疫球蛋白或多克隆免疫球蛋白的轻链和/或重链的任何组合，可以通过在含有或不含有还原剂的缓冲液中稀释样品来鉴定。与在使用质谱进行电离和检测之前采用纯化的其他方法相比，该方法的执行速度更快，从而降低了成本并提高了通量。申请人出乎意料地发现，即使在相对复杂的样品(如血液、血清、血浆或脑脊液)中，通过使用水或水性缓冲液稀释样品或甚至重构干燥的样品，也可以检测和定量免疫球蛋白。本专利技术提供了用于鉴定和/或定量样品中单克隆和/或多克隆免疫球蛋白的方法，其包括以下步骤：(i)提供含有来自对象的免疫球蛋白的样品；(ii)用水或水性缓冲液稀释所述样品以形成稀释的样品；(iii)电离所述稀释的样品，并通过质谱检测和任选地定量完整的免疫球蛋白或所述免疫球蛋白的轻链或重链。质谱可本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.用于鉴定和/或定量样品中单克隆免疫球蛋白和/或多克隆免疫球蛋白的方法，其包括以下步骤：/n(i)提供含有来自对象的免疫球蛋白的血液、血清、血浆或脑脊液的样品；/n(ii)用水或水性缓冲液稀释所述样品以形成稀释的样品；/n(iii)电离所述稀释的样品，并通过质谱检测和任选地定量完整的免疫球蛋白或所述免疫球蛋白的轻链或重链。/n
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180524 GB 1808529.0;20180504 US 62/667,0761.用于鉴定和/或定量样品中单克隆免疫球蛋白和/或多克隆免疫球蛋白的方法，其包括以下步骤：
(i)提供含有来自对象的免疫球蛋白的血液、血清、血浆或脑脊液的样品；
(ii)用水或水性缓冲液稀释所述样品以形成稀释的样品；
(iii)电离所述稀释的样品，并通过质谱检测和任选地定量完整的免疫球蛋白或所述免疫球蛋白的轻链或重链。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述样品被至少部分干燥，并用所述水或水性缓冲液再水化。
3.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中在通过质谱检测和任选地定量所述完整的免疫球蛋白或轻链或重链之前，所述免疫球蛋白未被富集。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述免疫球蛋白未通过亲和纯化或尺寸排除色谱法富集。
5.如权利要求1至4所述的方法，其中所述质谱是液相色谱电喷雾电离质谱(LC-ESI-MS)。
6.如权利要求1至5所述的方法，其中在电离之前将所述稀释的样品与...
【专利技术属性】
技术研发人员：达纳杰·萨克里卡，斯蒂芬·哈丁，大卫·巴尼奇，米歇尔·拉杰科，
申请(专利权)人：结合点集团有限公司，
类型：发明
国别省市：英国;GB
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