基于Fe制造技术

本发明专利技术公开了基于Fe

【技术实现步骤摘要】
基于Fe3O4@SiO2@TiO2纳米粒子富集和PSMA传感器检测前列腺癌外泌体的方法
本专利技术应用于外泌体标记物检测分析
，涉及一种基于TiO2和PSMA适配体对前列腺癌外泌体的快速准确分析测定。
技术介绍
前列腺癌(PCa)是全球男性最常见的实体恶性肿瘤。在早期，它有很高的治愈率，因此，前列腺癌的治疗依赖于早期诊断。前列腺特异抗原(PSA)是前列腺癌诊断的一种血清生物标志物。然而，虽然PSA具有很高的敏感性，但它的特异性很差，尤其是在血清PSA水平为2-10ng/mL的男性中，因此，泌尿外科需要其他特异的PCa生物标志物。外泌体是由正常细胞和肿瘤细胞分泌的包裹在脂质双层膜内的生物小泡，其大小从30到200纳米不等。外泌体在细胞间通讯中发挥着不同的作用，在体液中广泛存在，包括血液、尿液、唾液等。肿瘤外泌体包含肿瘤特异性蛋白、RNAs，并参与肿瘤的发生和病原体的扩散等。许多研究表明肿瘤外泌体是诊断癌症的一种理想的标记物，但是目前其分离和检测方法仍存在挑战。超速离心是最常用的外泌体分离方法，但是步骤复杂，分离效率低。商用ELISA试剂盒基于免疫亲和方法以CD-63,CD-9(外泌体表面抗体)等作为靶标分离和检测外泌体，灵敏度高，但是过程复杂并且成本高昂。TiO2由于其与磷酸集团的可逆性结合作用，广泛应用于磷酸肽段和蛋白的分离富集，而外泌体表面富含磷酸基团，因此可以采用TiO2分离富集外泌体。有文献报道TiO2可以成功实现外泌体的富集，但是后续采用离心方法进行固液分离可能会损失大量外泌。<br>
技术实现思路
为了克服现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种快速、高灵敏、高特异性的检测前列腺癌外泌体的方法。本专利技术的技术方案具体介绍如下。本专利技术提供一种基于Fe3O4@SiO2@TiO2纳米粒子富集和PSMA传感器检测前列腺癌外泌体的方法，包括如下步骤：1)合成Fe3O4@SiO2@TiO2纳米粒子，与含前列腺细胞外泌体的样本共孵育并磁性分离，实现外泌体的分离；2)将分离得到的外泌体与前列腺特异性膜抗原(PSMA)传感器共孵育，并获得荧光强度信号，通过测得荧光强度的改变对外泌体进行定量。进一步，步骤1)中，Fe3O4@SiO2@TiO2纳米粒子制备方法如下：将Fe3O4溶于乙醇、去离子水和氨水的混合物中，超声，接着加入TEOS，室温下连续搅拌反应，得到Fe3O4@SiO2；将Fe3O4@SiO2溶于乙醇和氨水的混合物中，超声后，用连续搅拌逐滴加入溶于乙醇的钛酸四丁酯。连续搅拌反应，制备好的产品用超纯水和乙醇洗涤，烘干后得到Fe3O4@SiO2@TiO2纳米粒子。进一步，本专利技术中进行外泌体分离的较优条件为：1.2mgFe3O4@SiO2@TiO2，常温孵育8分钟。进一步，步骤1)中，磁性分离后，碱液洗脱。进一步，洗脱步骤使用10％氨水与磁性分离得到的Fe3O4@SiO2@TiO2/外泌体复合物震摇共孵育。优选的，洗脱步骤使用10％氨水与磁性分离得到的Fe3O4@SiO2@TiO2/外泌体复合物在4摄氏度条件下震摇共孵育10分钟达到充分洗脱。进一步，步骤2)中，构建发卡状PSMA传感器如下：通过对PSMA抗体序列进行设计，使其形成发卡状结构，并在相应3’端和5’修饰上羧基四甲基罗丹明荧光基团(TAMRA)和偶氮苯甲酸(Dabcyl)猝灭基团。进一步，步骤2)中，PSMA抗体核苷酸序列如SEQNo.3所示。进一步，PSMA传感器浓度400nM，25度共孵育30分钟。进一步，步骤2)中，获得荧光强度的条件：激发光557纳米，发射光580纳米。本专利技术还提供一种Fe3O4@SiO2@TiO2纳米粒子，所述纳米粒子制备方法如下：将Fe3O4溶于乙醇、去离子水和氨水的混合物中，超声，接着加入TEOS，室温下连续搅拌反应，得到Fe3O4@SiO2；将Fe3O4@SiO2溶于乙醇和氨水的混合物中，超声后，用连续搅拌逐滴加入溶于乙醇的钛酸四丁酯。连续搅拌反应，制备好的产品用超纯水和乙醇洗涤，烘干后得到Fe3O4@SiO2@TiO2纳米粒子。本专利技术还提供一种Fe3O4@SiO2@TiO2纳米粒子在前列腺癌外泌体检测中的用途，利用Fe3O4@SiO2@TiO2纳米粒子，与外泌体共孵育并磁性分离，实现外泌体的分离和富集。本专利技术提供一种前列腺癌外泌体检测装置，所述检测装置中采用Fe3O4@SiO2@TiO2纳米粒子对外泌体进行分离富集，并与PSMA传感器共孵育。具体的，本专利技术一个实施例中，本专利技术合成Fe3O4@SiO2@TiO2纳米粒子用于外泌体的富集，主要是基于TiO2与磷酸基团的可逆性结合。然后设计了前列腺特异性膜抗原(PSMA)传感器。PSMA是前列腺癌外泌体表面一种特异的蛋白，在前列腺病外泌体表面高表达，在正常外泌体上低表达，通过检测PSMA实现对前列腺外泌体的特异性检测。PSMA传感器由PSMA蛋白适配体，TAMRA荧光基团和Dabcyl猝灭基团组成的发卡状结构，构建完成后，PSMA传感器由于荧光共振能量转移效应TAMRA的荧光被猝灭，当遇到外泌体时，PSMA适配体与外泌体表面PSMA蛋白特异结合，使荧光共振能量转移效应消失，TAMRA重新发射荧光，通过这种荧光的改变实现对外泌体的检测。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：本专利技术合成Fe3O4@SiO2@TiO2，以Fe3O4作为内核，SiO2有利于两种材料的连接，在富集完成后，可以快速磁性分离，减少外泌体损失。本专利技术结合Fe3O4快速磁性分离的优势和SiO2广泛相容性，合成了Fe3O4@SiO2@TiO2纳米粒子以快速高效分离外泌体。同时设计了前列腺癌特异蛋白PSMA传感器，特异性识别前列腺癌外泌体。本专利技术集富集与检测为一体，对前列腺癌外泌体实现快速准确分析鉴定具体的，本专利技术富集外泌体方法基于Fe3O4@SiO2@TiO2纳米粒子。富集外泌体是基于TiO2与磷酸基团的特异性结合，TiO2尺寸大概为600纳米，相比于外泌体尺寸，比表面积大，可以结合较多外泌体。因此富集效率高，富集效率为91.5％，本专利技术合成的Fe3O4@SiO2@TiO2纳米粒子也可以富集其他含磷酸基团的多肽，蛋白等。以Fe3O4作为内核，富集后可以快速磁性分离，在8分钟内完成富集，简单快速。本专利技术检测外泌体的方法灵敏度高，特异性强，检出限为9×103个/μL，可以显著性区分临床前列腺癌病人与健康人(P<0.01)，并得到传统ELISA方法验证。本专利技术包括富集与检测外泌体两部分，分离方法简单快速，效率高，检测方法灵敏度高特异性好，适用于临床前列腺癌早期诊断。附图说明图1为Fe3O4@SiO2@TiO2的表征。(a)Fe3O4的透射电镜(TEM)图像。标尺，100纳米。(b)Fe3O4@SiO2的TEM。标尺0.2μm。(c)Fe3O4@SiO2@TiO2的TEM。标尺500纳米。(d)Fe3本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.基于Fe

【技术特征摘要】
1.基于Fe3O4@SiO2@TiO2纳米粒子富集和PSMA传感器检测前列腺癌外泌体的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)合成Fe3O4@SiO2@TiO2纳米粒子，与含前列腺细胞外泌体的样本共孵育并磁性分离，实现外泌体的分离；
2)将分离得到的外泌体与PSMA传感器共孵育，并获得荧光强度信号，通过测得荧光强度的改变对外泌体进行定量。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中，Fe3O4@SiO2@TiO2纳米粒子制备方法如下：
1)将Fe3O4溶于乙醇、去离子水和氨水的混合物中，超声，接着加入TEOS，室温下连续搅拌反应，得到Fe3O4@SiO2；
2)将Fe3O4@SiO2溶于乙醇和氨水的混合物中，超声后，用连续搅拌逐滴加入溶于乙醇的钛酸四丁酯。连续搅拌反应，制备好的产品用超纯水和乙醇洗涤，烘干后得到Fe3O4@SiO2@TiO2纳米粒子。


3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中，磁性分离后，碱液洗脱。


4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，洗脱步骤使用10％氨水与磁性分离得到的Fe3O4@SiO2@TiO2/外泌体复合物震摇共孵育。


5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中，构建发卡状PSMA传感器如下：通...

【专利技术属性】
技术研发人员：李巧玉，施海梅，余绍宁，
申请(专利权)人：宁波大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33