用于特异性检测鞘磷脂酶的比率型荧光纳米脂质体探针、试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术公开了用于特异性检测鞘磷脂酶的比率型荧光纳米脂质体探针、试剂盒及检测方法。本发明专利技术提供的用于检测酶活性的探针，为内部包覆荧光体Ⅰ和荧光体Ⅱ的纳米脂质体；所述荧光体Ⅰ和所述荧光体Ⅱ在所述纳米脂质体内能够发生荧光共振能量转移；待检测的酶能够水解并破坏所述纳米脂质体的脂膜使所述荧光体Ⅰ和所述荧光体Ⅱ分离。具体地，所述酶为鞘磷脂酶；所述脂质体为鞘磷脂脂质体；所述荧光体Ⅰ为cy7且所述荧光体Ⅱ为IR780。本发明专利技术探针中，脂质体为鞘磷脂酶的天然底物，生物相容性好，合成简单；利用该探针对酶活性进行检测的方法具有较高的选择性和灵敏性，可用于腹膜炎患者的细胞和尿液样品中酸性鞘磷脂酶活性的检测。和尿液样品中酸性鞘磷脂酶活性的检测。

【技术实现步骤摘要】
用于特异性检测鞘磷脂酶的比率型荧光纳米脂质体探针、试剂盒及检测方法


[0001]本专利技术属于荧光探针、生物化学、纳米生物医学领域，尤其涉及用于特异性检测鞘磷脂酶的比率型荧光纳米脂质体探针、试剂盒及检测方法。

技术介绍

[0002]鞘磷脂酶是一种酸性糖蛋白，是一类水解酶，催化鞘磷脂降解成神经酰胺和磷酸化胆碱。在哺乳动物中，根据其阳离子依赖性和最适作用pH值，已经确定了五种类型的鞘磷脂酶：溶酶体酸鞘磷脂酶、分泌型锌依赖酸鞘磷脂酶、镁依赖中性鞘磷脂酶、镁非依赖中性鞘磷脂酶和碱性鞘磷脂酶。
[0003]现有的检测鞘磷脂酶活性的方法中，存在放射性元素的危害，对人和环境不友好，且合成复杂，操作繁琐，可能呈现假信号等缺点。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供用于特异性检测鞘磷脂酶的比率型荧光纳米脂质体探针、试剂盒及检测方法，该探针生物相容性好、合成方法简单，利用该探针对鞘磷脂酶活性进行检测的方法选择性和灵敏性较高。
[0005]本专利技术的第一个目的是提供用于检测酶活性的探针，该探针为内部包覆荧光体Ⅰ和荧光体Ⅱ的纳米脂质体；
[0006]所述荧光体Ⅰ和所述荧光体Ⅱ在所述纳米脂质体内能够发生荧光共振能量转移；
[0007]待检测的酶能够水解并破坏所述纳米脂质体的脂膜使所述荧光体Ⅰ和所述荧光体Ⅱ分离。
[0008]上述的探针中，所述酶具体可为鞘磷脂酶，如酸性鞘磷脂酶；所述脂质体具体可为鞘磷脂脂质体。
[0009]优选地，所述荧光体Ⅰ具体可为式Ⅰ所示化合物(简写为cy7)且所述荧光体Ⅱ具体可为式Ⅱ所示化合物(如IR780)：
[0010][0011][0012]式Ⅱ中，X为卤素，如Cl、Br、I。
[0013]上述的探针中，所述荧光体Ⅰ和所述荧光体Ⅱ的摩尔比具体可为2：1。
[0014]上述的探针中，所述纳米脂质体的尺寸可为60～300nm，最大含量尺寸可为100nm，约呈正态分布。所述纳米脂质体为双分子层结构。
[0015]本专利技术的第二个目的是提供上述探针的制备方法，包括如下步骤：
[0016](1)将磷脂和胆固醇在有机溶剂中混合后进行第一次超声，超声完毕后减压旋转蒸发除去溶剂，得到脂质体脂膜；
[0017](2)将所述脂质体脂膜与含有所述荧光体Ⅰ和所述荧光体Ⅱ的缓冲液混合后进行搅拌，搅拌完毕后进行第二次超声，得到所述探针。
[0018]上述的制备方法中，所述磷脂、所述胆固醇、所述荧光体Ⅰ和所述荧光体Ⅱ的摩尔比具体可为8:8:2:1。
[0019]所述有机溶剂具体可为氯仿；
[0020]所述磷脂和所述胆固醇在所述有机溶剂中的总摩尔浓度具体可为7.5μmol/mL；
[0021]所述第一次超声的频率为40KHz，时间为5min；
[0022]所述旋转蒸发的温度具体可为40℃。
[0023]所述含有荧光体Ⅰ和荧光体Ⅱ的缓冲液中，所述荧光体Ⅰ的浓度具体可为2mM；
[0024]所述搅拌的转速为800r，时间具体可为1h，温度具体可为40℃；
[0025]所述第二次超声的频率为40KHz，时间为10min。
[0026]所述方法还包括用截留分子量为3500道尔顿的膜去除未包覆的荧光体的步骤。
[0027]本专利技术的第三个目的是提供上述任一项所述的探针在下述A1)
‑
A7)至少一项中的应用：
[0028]A1)制备用于检测酶活性的产品；
[0029]A2)制备用于检测鞘磷脂酶活性的产品；
[0030]A3)制备用于诊断或辅助诊断腹膜炎的产品；
[0031]A4)制备用于诊断或辅助诊断心血管疾病的产品；
[0032]A5)制备用于诊断或辅助诊断动脉粥样硬化的产品；
[0033]A6)制备用于诊断或辅助诊断脂类代谢疾病的产品；
[0034]A7)制备用于诊断或辅助诊断结肠癌的产品。
[0035]上述的应用中，所述产品具体可为试剂盒。
[0036]上述的应用中，待检测的样品可为细胞、组织或体液。
[0037]本专利技术的第四个目的是提供用于检测酶活性的试剂盒，包括上述任一项所述的探针。所述试剂盒具体可包括上述任一项所述的探针和缓冲液。
[0038]上述的试剂盒还可包括可读性载体，所述可读性载体上记载有如下检测酶活性的步骤：
[0039]S1、对待测的酶样品、上述任一项所述的探针和缓冲液组成的初始体系进行孵育；
[0040]S2、在作为供体的荧光体的最大激发波长的激发下，检测步骤S1孵育后的体系中所述荧光体Ⅰ和所述荧光体Ⅱ的荧光光谱，计算所述荧光体Ⅰ和所述荧光体Ⅱ的荧光强度的比值，根据酶活性与所述比值的关系实现酶活性的检测。
[0041]上述的试剂盒中，步骤S1中，所述初始体系中探针的浓度可为1～2mM，优选为50mg/mL；
[0042]所述初始体系的pH值可为5.0；
[0043]所述孵育的温度可为37℃；所述孵育的时间可为90min；步骤S2中，所述作为供体的荧光体的最大激发波长为700nm；
[0044]所述荧光体Ⅰ和所述荧光体Ⅱ的荧光强度的比值为所述荧光体Ⅰ在750nm处的荧光强度和所述荧光体Ⅱ在830nm处的荧光强度的比值；
[0045]所述根据酶活性与比值的关系实现酶活性的检测可采用标准曲线法。
[0046]本专利技术的第五个目的是提供一种检测酶活性的方法，包括如下步骤：
[0047]S1、对待测的酶样品、上述任一项所述的探针和缓冲液组成的初始体系进行孵育；
[0048]S2、在作为供体的荧光体的最大激发波长的激发下，检测步骤S1孵育后的体系中所述荧光体Ⅰ和所述荧光体Ⅱ的荧光光谱，计算所述荧光体Ⅰ和所述荧光体Ⅱ的荧光强度的比值，根据酶活性与所述比值的关系实现酶活性的检测。
[0049]上述的方法中，步骤S1中，所述初始体系中探针的浓度可为1～2mM，优选为50mg/mL；
[0050]所述初始体系的pH值可为5.0；
[0051]所述孵育的温度可为37℃；所述孵育的时间可为90min；
[0052]步骤S2中，所述作为供体的荧光体的最大激发波长为700nm；
[0053]所述荧光体Ⅰ和所述荧光体Ⅱ的荧光强度的比值为所述荧光体Ⅰ在750nm处的荧光强度和所述荧光体Ⅱ在830nm处的荧光强度的比值；
[0054]所述根据酶活性与比值的关系实现酶活性的检测可采用标准曲线法。
[0055]本专利技术具有如下有益效果：
[0056](1)本专利技术探针为内部包覆能够发生荧光共振能量转移的两种荧光体的纳米脂质体，该脂质体为鞘磷脂酶的天然底物，生物相容性好，合成简单。
[0057](2)本专利技术方法具有较高的选择性和灵敏性。
[0058](3)本专利技术探针和检测方法可用于腹膜炎患者的细胞和尿液样品中酸性鞘磷脂酶活性的检测，可进一步诊断或辅助诊断腹膜炎。本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于检测酶活性的探针，为内部包覆荧光体Ⅰ和荧光体Ⅱ的纳米脂质体；所述荧光体Ⅰ和所述荧光体Ⅱ在所述纳米脂质体内能够发生荧光共振能量转移；待检测的酶能够水解并破坏所述纳米脂质体使所述荧光体Ⅰ和所述荧光体Ⅱ分离。2.根据权利要求1所述的探针，其特征在于：所述酶为鞘磷脂酶；所述脂质体为鞘磷脂脂质体；优选地，所述荧光体Ⅰ为式Ⅰ所示化合物且所述荧光体Ⅱ为式Ⅱ所示化合物：式Ⅱ中，X为卤素；优选地，所述荧光体Ⅰ和所述荧光体Ⅱ的摩尔比为2：1；优选地，所述纳米脂质体的尺寸为60～300nm。3.权利要求1或2所述的探针的制备方法，包括如下步骤：(1)将磷脂和胆固醇在有机溶剂中混合后进行第一次超声，减压旋转蒸发除去溶剂，得到脂质体脂膜；(2)将所述脂质体脂膜与含有所述荧光体Ⅰ和所述荧光体Ⅱ的缓冲液混合后进行搅拌，搅拌完毕后进行第二次超声，得到所述探针。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述磷脂、所述胆固醇、所述荧光体Ⅰ和所述荧光体Ⅱ的摩尔比为8:8:2:1；所述有机溶剂为氯仿；所述磷脂和所述胆固醇在所述有机溶剂中的总摩尔浓度为7.5μmol/mL；所述第一次超声的频率为40KHz，时间为5min；所述旋转蒸发的温度为40℃；所述含有荧光体Ⅰ和荧光体Ⅱ的缓冲液中，所述荧光体Ⅰ的浓度为2mM；所述搅拌的转速为800r，时间为1h，温度为40℃；
所述第二次超声的频率为40KHz，时间为10min。5.权利要求1或2所述的探针在下述A1)
‑
A7)至少一项中的应用：A1)制备用于检测酶活性的产品；A2)制备用于检测鞘磷脂酶活性的产品；A3...

【专利技术属性】
技术研发人员：张阳阳，吴文静，赵镇文，
申请(专利权)人：中国科学院化学研究所，
类型：发明
国别省市：