一种精准调控组装制备稳定酶蛋白环的方法技术

本发明专利技术涉及一种精准调控组装制备稳定酶蛋白环的方法，用醛酮还原酶作为模型蛋白，通过定点插入4

【技术实现步骤摘要】
一种精准调控组装制备稳定酶蛋白环的方法


[0001]本专利技术涉及一种酶蛋白环的组装方法，具体地说是涉及一种精准调控组装制备稳定酶蛋白环的方法。

技术介绍

[0002]自然界呈现出惊人的复杂组装系统，这些系统由各种原材料组成，特别是各种生物大分子，如蛋白质。这激发了科学家们在实验室中探索和控制生物大分子组装过程的雄心，以作为纳米材料、混合生物催化剂、组织工程主机和药物输送剂的用途。在分子水平上，从下到上组装成有组织的纳米结构将使系统具有新的特性。蛋白质是生物体极为通用的构件，因为它们在自然界中具有复杂的拓扑结构以及广泛的功能。此外，内在的生物利用度、较小的毒性、生物降解性、非抗原性、高营养价值、丰富的可再生资源、对各种药物的非凡结合能力等，也使它们能够成为自下而上构建功能性生物材料的理想构建模块。与简单的DNA分子相比，蛋白质的可编程组装仍处于相对早期的发展阶段，但由于组装结构的复杂性和功能的多样性，它拥有巨大的潜力。
[0003]在组装蛋白质方面，获得功能性生物材料的主要任务是操纵蛋白质组装成预定的和有组织的结构。构建和调整组装的蛋白质纳米结构的策略主要取决于对蛋白质的深入研究和对蛋白质与蛋白质之间相互作用的仔细分析和设计，如静电力、氢键等，通过生物技术驱动蛋白质结合。最近，超分子相互作用，如金属配位、宿主客体、静电相互作用、π
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π相互作用和氢键，已被探索用于介导蛋白质的组装。超分子化学已经提供了许多非常有用的化学策略来制造蛋白质的组装。基因或化学连接的超分子自组装元素可以用来控制蛋白质自组装过程的热力学和动力学。
[0004]然而，蛋白质是由多肽链形成的，可以通过分子内的非共价相互作用折叠成特定的三维形状，并具有形态上的异质性、灵活性和复杂性等特点。这些都是蛋白质结构的重要特征，对复杂的细胞功能至关重要，在许多情况下，也是控制蛋白质聚集过程的顺序和方向的主要障碍。此外，蛋白质结构的不稳定性还部分来源于环境因素，如pH值、温度、离子强度和溶剂选择，这进一步增加了蛋白质操作的难度。这些缺陷使得蛋白质的自组装更具挑战性。利用蛋白质之间的作用力和与超分子的结合进行的蛋白质组装也是不稳定的，而且环境对其有很大的影响。有人提出，溶液的离子强度会导致聚集物的分解。上述蛋白质的组装主要依靠分子间的力量，由于分子间力与共价键相比相对较小，它们受环境的影响很大，因此不稳定。而且它们通过外部条件调节蛋白质聚集体的形状，使其难以用于催化合成的应用。此外，目前许多自下而上的纳米技术的应用，特别是DNA纳米技术，都依赖于对少数目标特征(通常是蛋白质)的定位或显示，其精确度为数纳米；通过自下而上的组装策略，可以设计和构建一个新的高度有序的蛋白质结构；为了实现对蛋白质的完全控制，可以人为地生产具有更高尺寸和更复杂结构的更大的蛋白质超级结构。然而，在精确控制蛋白质组装方面需要克服的一个主要缺点是，蛋白质表面不提供复杂的配体，这些配体可以相互作用，并总是以不可预测的方式组装。

技术实现思路

[0005]为了克服现有技术存在的不足，本专利技术提供了一种精准调控组装制备稳定酶蛋白环的方法，本专利技术可以实现酶蛋白的快速精准组装；本专利技术从细胞裂解液中直接进行共价交联形成的环状组装体，并且通过改变酶链上基团的位置(控制其位点)、浓度以及交联剂的用量能够对酶蛋白形貌进行精准调控；本专利技术可以提高催化活性和组装的稳定性，实现自我纯化，同时得到的酶蛋白组装体的尺寸可以达到μm级别。
[0006]为了达到上述目的，本专利技术采用的技术方案是：
[0007]一种精准调控组装制备稳定酶蛋白环的方法，包括下述步骤：首先，用醛酮还原酶(AKR)作为模型蛋白，并与两个4
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叠氮基
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L
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苯丙氨酸(p
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Azido
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L
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苯丙氨酸，pAzF)分子结合，得到醛酮还原酶两点突变体；然后，双炔交联剂在微波的作用下用细胞裂解液诱导了共价组装；通过控制细胞裂解上清液中的蛋白质浓度、突变位点以及交联剂的用量来调控酶蛋白组装体的形貌，得到环状交联酶蛋白。
[0008]首先，我们利用遗传密码扩展，将两个p
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Azido
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L
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苯丙氨酸(pAzF,4
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叠氮基
‑
L
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苯丙氨酸)纳入醛酮还原酶(AKR)，产生AKR两点突变体。然后，在孵化和细胞裂解后，使用二炔(sym
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Dibenzo
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1,5
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cyclooctadien
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3,7
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diyne)双功能交联剂促进的烷基
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叠氮环化反应(SPAAC)，在微波辐照下从细胞裂解液中进行蛋白质组装；设定醛酮还原酶与炔基的反应摩尔比以及改变被替代的位点的来调控蛋白组装体的形貌；通过AFM、SEM以及CLSM对蛋白组装体的形貌进行表征。
[0009]本专利技术可以从细胞裂解液中直接进行共价交联形成环状酶蛋白组装体。
[0010]作为优选，选取了远离活性中心和活性位点的六个位点，得到了五个不同空间距离的醛酮还原酶两点突变体。
[0011]作为优选，醛酮还原酶与双炔交联剂的摩尔比为1：0.8～2。
[0012]作为优选，细胞裂解上清液中的蛋白质浓度为5.02mg
·
mL
‑1～60.13mg
·
mL
‑1。
[0013]作为优选，所述双炔交联剂为5,6,11,12
‑
四氢二苯并[a,e]环辛烯，使用时将双炔交联剂溶解在异丙醇中，使其浓度为0.66mg
·
mL
‑1。
[0014]作为优选，醛酮还原酶两点突变体分别为AKR
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114Y
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189Q、AKR
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3Y
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31Y、AKR
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3Y
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189Q、AKR
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198Y
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232W以及AKR
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3Y
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232W。醛酮还原酶的突变位点的选择要使突变位点远离蛋白活性中心和活性位点并突变为TAG密码子，并且选取的这五个两点的位点之间的空间距离有所不同。
[0015]作为优选，微波温度为10℃，微波功率为10W，微波时间为1～7min。
[0016]作为优选，使大肠杆菌成为诱导醛酮还原酶基因表达的宿主，并以离心获得细胞沉淀，离心的转数为7000～9000rpm，时间为4～8min，并用PBS缓冲液洗涤沉淀；沉淀重悬于PBS中并通过超声处理裂解细胞，其中PBS加入量为原菌液体积的1/6～1/4，其中PBS浓度为0.02M，pH为7.0，超声破碎采用冰浴，功率300～500W，破碎时间8～13min，其中每10s设置破碎3s停7s；细胞破碎后本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种精准调控组装制备稳定酶蛋白环的方法，其特征在于包括下述步骤：首先，用醛酮还原酶作为模型蛋白，并与两个4
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叠氮基
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L
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苯丙氨酸分子结合，得到醛酮还原酶两点突变体；然后，双炔交联剂在微波的作用下用细胞裂解液诱导了共价组装；通过控制细胞裂解上清液中的蛋白质浓度、突变位点以及交联剂的用量来调控酶蛋白组装体的形貌，得到环状交联酶蛋白。2.根据权利要求1所述精准调控组装制备稳定酶蛋白环的方法，其特征在于：选取了远离活性中心和活性位点的六个位点，得到了五个不同空间距离的醛酮还原酶两点突变体。3.根据权利要求1所述精准调控组装制备稳定酶蛋白环的方法，其特征在于：醛酮还原酶与双炔交联剂的摩尔比为1：0.8～2。4.根据权利要求1所述精准调控组装制备稳定酶蛋白环的方法，其特征在于：细胞裂解上清液中的蛋白质浓度为5.02mg
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mL
‑1～60.13mg
·
mL
‑1。5.根据权利要求1所述精准调控组装制备稳定酶蛋白环的方法，其特征在于：所述双炔交联剂为5,6,11,12
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四氢二苯并[a,e]环辛烯，使用时将双炔交联剂溶解在异丙醇中，使其浓度为0.66mg
·
mL
‑1。6.根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：王安明，章鹏飞，张静，
申请(专利权)人：杭州师范大学，
类型：发明
国别省市：