一种高效热启动Taq酶的优化及制备方法技术

本发明专利技术公开了一种高效Taq酶的冻干保护剂，由如下的一种或几种组合形成：10mM~50mM Tris

【技术实现步骤摘要】
一种高效热启动Taq酶的优化及制备方法
[0001]
：本专利技术属于生物制剂
，特别涉及一种高效热启动Taq酶的优化及制备方法。
[0002]
技术介绍
：PCR（聚合酶链式反应）是一种用于放大扩增特定DNA片段的分子生物学技术，利用DNA在体外95℃高温时变性会变成单链，低温（经常是60℃左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72℃左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖（5'
‑
3'）的方向合成互补链。PCR技术被广泛运用于医学和生物学的实验室，例如用于判断体检中是否会表现某遗传疾病的图谱、传染病的诊断、基因诊断、基因复制以及亲子鉴定等。
[0003]PCR反应所必需的DNA聚合酶目前广泛采用水生栖热菌 Thermus Aquaticus ( Taq )中分离出的具有热稳定性的DNA聚合酶，因此被称为Taq酶。起作用是通过构建磷酸二酯键将脱氧核苷酸聚合形成脱氧核苷酸链，从而形成DNA分子。Taq酶对于PCR的应用有里程碑的意义，一般常用的Taq酶可以分为rTaq酶和LTaq酶两类，LTaq酶的保真性更强，耐热性也比rTaq酶好。多数酶在高温时即变性失活，然而Taq酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，所以不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷。同时也大大降低了成本，PCR技术得以大量应用，并逐步应用于临床。在广泛应用的PCR操作中，Taq酶的缺点是缺少3到5校正外切酶活性，因此在复制DNA时有时会出错，造成DNA序列的错误。为了避免操作过程中产生非特异性序列的扩增，研究人员对PCR技术进行了改良，专利技术了热启动聚合酶链式反应（Hot start PCR）。该技术将聚合酶与反应体系中的隔离，或是使用在高热状态下才会活化的聚合酶（热启动Taq酶），该酶在90℃以上才能发挥很好的催化效果，以避免在未达到设定温度前就开始反应。
[0004]目前热启动PCR方式包括：（1）蜡隔绝法：是将除了聚合酶以外的反应物加入PCR反应管中，加入熔融的石蜡；待石蜡凝固后再加入聚合酶。放入PCR仪后在升温阶段石蜡融化浮至最上层，聚合酶才和PCR反应体系中的其他反应物接触混合，石蜡同时还具有防止蒸发的作用。（2）化学修饰热启动聚合酶：用甲醛，酸酐等化学分子修饰聚合酶，在高热下聚合酶结构改变而启动。（3）抗体修饰热启动聚合酶：用带有针对热启动聚合酶的免疫抗体封闭酶活性中心，在高热下聚合酶与抗体分离而启动。（4）共价键结合修饰热启动聚合酶：用小分子的化合物封闭酶的活性中心，在高热下聚合酶与抗体分离而启动。
[0005]公开于该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理 解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术 人员所公知的现有技术。
[0006]
技术实现思路
：本专利技术的目的在于提供一种高效热启动Taq酶的优化及制备方法，从而克服上述现有技术中的缺陷。
[0007]为实现上述目的，本专利技术提供了一种高效Taq酶的冻干保护剂，由如下的一种或几
种组合形成：10mM ~50mM Tris
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HCl（Ph 8.0）、5%~30%海藻糖、1%~10%甘露醇、1mg/ml~10mg/ml牛血清白蛋白、5mM ~30mM叠氮化钠、0.01%~0.1%吐温20、5%~50%甘油、0.05%~0.5%SE
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15、焦磷酸二乙酯处理过的水。对冻干所需的保护剂进行了优化，使冻干后的酶制剂成品性能更加稳定，存储时间更长。
[0008]一种酶贮存缓冲液，由如下的一种或几种组合形成：10mM ~50mM Tris
‑
HCl（Ph 8.0）、0.01 mM ~0.5mM EDTA、0.1 mM ~10mM DTT、50 mM ~500mM KCl、1~3％硫酸铵、1 mM ~5mM叠氮化钠、20mg/ml ~100mg/ml羟丙基
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beta
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环糊精、1~5M甜菜碱、0 .1~1％BSA、50~110mM PVP、1~5％柠檬酸钾、10%~70%甘油。对酶贮存缓冲液包含组分进行了优化，使液体状态的酶制剂性能可以更加稳定，存储时间更长。
[0009]一种适用于高效热启动Taq酶的冻干方法，包括：预冻、升华干燥和解析干燥三个阶段；预冻设置为：第一阶段预冻温度在10min~40min内达到0 ℃ ~20℃，保持0.5~2 h；第二阶段预冻温度在10min~50min内达到
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20℃~
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50℃，保持1 h ~5 h；升华干燥设置为：第一阶段升华干燥温度在5min~40min内达到
‑
45℃ ~
ꢀ‑
30℃，保持1~3h，真空度为0 Pa ~30Pa；第二阶段升华干燥温度在5min ~ 40min内达到
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35℃~
ꢀ‑
20℃，保持5~20 h，真空度为0 Pa ~30Pa；解析干燥设置为：第一阶段解析干燥温度在10min~50min内达到10℃~20℃，保持1 h~3h，真空度为0 Pa；第二阶段解析干燥温度在10min~50min内达到15℃~30℃，保持2 h~7 h，真空度为0 Pa。
[0010]对冻干程序参数进行了优化，极大的提高了冻干制剂的性状，保证了冻干制剂的稳定性，同时使所得的冻干制剂具有美观的形态。高效热启动Taq酶制剂通过通过冻干制备成冻干制剂后，其制备方法简单、特异性强，灵敏度高、重现性好，容易实现大规模生产，且更加方便客户使用和保存。
[0011]优选地，上述技术方案中，预冻结束后还设有退火操作，具体操作为在15min内退火温度达到
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30℃，并保持1.5h。退火能够改变冰晶颗粒的晶型及其尺寸大小，强化结晶，提高了制品的均匀性。退火可以提高非晶相冻结浓缩液的玻璃化转变温度，对升华干燥阶段以及和解析干燥阶段都有重大意义，使冻干制剂的性质更加稳定。退火也直接影响了冻干制品的质量外观等。
[0012]优选地，上述技术方案中，在冷冻干燥结束后，真空状态下冲入惰性气体，箱内压塞后出箱。
[0013]优选地，上述技术方案中，惰性气体为氮气、氩气、氦气、二氧化碳中的一种。
[0014]优选地，上述技术方案中，高效Taq酶制剂通过真空冷冻干燥得到的冻干制剂成品的含水量为0.1%~5%。冻干制剂含水量低，可以延长核酸检测试剂的保质期。高效热启动Taq酶制剂通过冻干制备成冻干制剂后，可以完全摆脱冷链运输的限制，实现常温条件下运输。
[0015]一种适用于高效热启动Taq酶的冻干制剂制备方法，其特征在于，在高效热启动Taq酶的真空冷冻干燥过程中加入1/3体积的冻干保护剂。
[0016]一种热启动Taq酶的优化制备方法，使用单克隆抗体对Taq酶的活性中心进行封闭获得。通过单克隆抗体修饰、适配体修饰和单链结合蛋白修饰方法对热启动Taq酶进行热启动修饰，明显提高了荧光PCR的扩增效率（尤其对于低拷贝数模板），改善了本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高效Taq酶的冻干保护剂，其特征在于：由如下的一种或几种组合形成：10mM ~50mM Tris
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HCl（Ph 8.0）、5%~30%海藻糖、1%~10%甘露醇、1mg/ml~10mg/ml牛血清白蛋白、5mM ~30mM叠氮化钠、0.01%~0.1%吐温20、5%~50%甘油、0.05%~0.5%SE
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15、焦磷酸二乙酯处理过的水。2.一种酶贮存缓冲液，其特征在于：由如下的一种或几种组合形成：10mM ~50mM Tris
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HCl（Ph 8.0）、0.01 mM ~0.5mM EDTA、0.1 mM ~10mM DTT、50 mM ~500mM KCl、1~3％硫酸铵、1 mM ~5mM叠氮化钠、20mg/ml ~100mg/ml羟丙基
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beta
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环糊精、1~5M甜菜碱、0 .1~1％BSA、50~110mM PVP、1~5％柠檬酸钾、10%~70%甘油。3.一种适用于高效热启动Taq酶的冻干方法，其特征在于，包括：预冻、升华干燥和解析干燥三个阶段；所述的预冻设置为：第一阶段预冻温度在10min~40min内达到0 ℃ ~20℃，保持0.5~2 h；第二阶段预冻温度在10min~50min内达到
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20℃~
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50℃，保持1 h ~5 h；所述的升华干燥设置为：第一阶段升华干燥温度在5min~40min内达到
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45℃ ~
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30℃，保持1~3h，真空度为0 Pa ~30Pa；第二阶段升华干燥温度在5min ~ 40min内达到
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35℃~
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20℃，保持5~20 h，真空度为0 Pa ~30Pa；所述的解析干燥设置为：第一阶段解析干燥温度在10min~50min内达到10℃~20℃，保持1 h~3h，真空度为0 Pa；第二阶段解析干燥温度在10min~50min内达到15℃~30℃，保持2 h~7 h，真空度为0 Pa。4.根据权利要求3所述的适用于高效热启动Taq酶的冻干方法，其特征在于，预冻阶...

【专利技术属性】
技术研发人员：王河清，王晓敏，张蓉，邱欢欢，李瑞雪，刘中华，王国强，
申请(专利权)人：江苏硕世生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：