制备高纯度PIC的试剂和方法技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，具体涉及制备高纯度PIC的试剂和方法，利用金属盐和低浓度EACA配合纯化PIC，获得了高纯度的PIC，可用作免疫原应用于医疗诊断之中，且本方法的纯化只采用一次EACA洗脱，操作简便。操作简便。操作简便。

【技术实现步骤摘要】
制备高纯度PIC的试剂和方法


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及制备高纯度PIC的试剂和方法。

技术介绍

[0002]PIC在机体纤溶系统激活时由α2
‑
纤溶酶抑制剂(α2
‑
plasmin inhibition，α2
‑
PI)与纤溶酶(plasmin，P)所形成，PIC也称为纤溶酶
‑
α2
‑
抗纤溶酶复合物((plasmin
‑
α2
‑
antiplasmin complex，PAP)，相对分子量约140ku，该复合物的产生标志着人体内纤溶酶的形成与纤溶系统的变化情况。
[0003]目前国内外制备PIC的方法主要有两种，第一种方法是在新鲜血浆中直接添加尿激酶激活生成PIC，采用亲和层析分布洗脱纯化PIC；第二种方法首先纯化α2
‑
纤溶酶抑制剂，然后纯化纤溶酶原其经尿激酶的作用形成纤溶酶，最后两者反应形成PIC，经亲和层析获得PIC。但利用现有的纯化方法，得到的PIC中还存在着各种杂蛋白，PIC纯度较低，不适合作为免疫原应用到体外诊断中，因此，制备高纯度的PIC对于医疗诊断来说具有重大意义。

技术实现思路

[0004]制备高纯度PIC的试剂，包括试剂a和b，所述试剂a含有：0.1
‑
1mol/L NaCl，所述试剂b含有：1
‑
100mmol/L EACA。
[0005]优选的，所述试剂b含有1<br/>‑
40mmol/L EACA。
[0006]优选的，所述试剂，还包括前处理试剂，所述前处理试剂为100
‑
300μg/mL的尿激酶。
[0007]更优选的，所述尿激酶为200μg/mL。
[0008]另一方面，本专利技术还公开了一种制备高纯度PIC的方法，所述方法为亲和层析，包括以下步骤：
[0009](a)上样；
[0010](b)润洗亲和柱；
[0011](c)加入a，洗脱杂质；
[0012](d)加入b，洗脱PIC；
[0013]其中，所述步骤(b)中，润洗亲和柱的溶液为：0.05mol/L PB pH 7.5，所述步骤(c)中a含有：0.1
‑
1mol/L NaCl，所述步骤(d)中b含有：1
‑
100mmol/LEACA。
[0014]优选的，所述步骤(d)中b含有1
‑
40mmol/L EACA。
[0015]优选的，还包括样本处理过程，所述样本处理过程为在样本中添加尿激酶，所述尿激酶浓度为100
‑
300μg/mL，优选为200μg/mL。
[0016]优选的，所述样本为血浆。
[0017]另一方面，本专利技术还公开了一种检测PIC的方法，所述方法包括以下步骤：
[0018](a)上样；
[0019](b)润洗亲和柱；
[0020](c)加入a，洗脱杂质；
[0021](d)加入b，洗脱PIC；
[0022](e)检测PIC的含量。
[0023]所述步骤(c)和(d)中的洗脱杂质和洗脱PIC可以采用凝胶电泳定性验证，再结合活性检测，确定PIC纯化的结果。
[0024]有益效果：
[0025](1)利用金属盐和低浓度EACA配合纯化PIC，获得了高纯度的PIC。
[0026](2)利用最佳浓度的尿激酶激活血浆，得到高浓度PIC样本。
[0027](3)只采用一次EACA洗脱，节约成本且操作简便。
附图说明
[0028]图1为尿激酶激活试验图；
[0029]图2为样本亲和层析洗图谱；
[0030]图3为PIC纯化验证凝胶电泳图；
[0031]图4为只用EACA洗脱凝胶电泳图；
[0032]图5为用EACA分步洗脱凝胶电泳图。
具体实施例
[0033]实施例1样品预处理
[0034]a)血浆的预处理
[0035]取冻存的高脂血浆快速解冻，4℃8500r/min离心30min，过滤。
[0036]b)尿激酶激活
[0037]取上述处理的血浆，按0.1
‑
3mg尿激酶/100mL血浆添加，37℃激活25min，以0.1
‑
2mg抑肽酶/100mL血浆的添加量加入以终止激活。
[0038]上述尿激酶的具体浓度为50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL和300μg/mL血浆。
[0039]本实施例中抑肽酶的浓度为50μg/mL血浆。
[0040]试验结果如图1所示，结果表明：随着尿激酶用量的增加，PIC浓度先增加；当添加量为200μg/mL，PIC浓度达到最大，此时PIC激活较彻底，当再提高尿激酶用量时，PIC的生成不再增加，为了节约成本，尿激酶含量选择200μg/mL血浆；纤溶酶原的激活程度决定了PIC的生成量及纯度，后续试验选择此条件下获得的PIC进行纯化。
[0041]实施例2Lysine
‑
sepharose层析
[0042]取上述已激活的血浆200mL，通过0.22μm滤膜，上Lysine
‑
sepharose层析柱，以0.05mol/L PB pH 7.5流速为1mL/min，冲洗20mL，以试剂a(0.05mol/L PB、0.1mol/L NaCl pH 7.5)洗去杂质，再以试剂b(0.05mol/L PB、5mmol/L EACA pH 7.5)洗脱，收集洗脱与洗杂液。
[0043]结果如图2所述，可以看出添加试剂a和试剂b之后，层析柱上有不同的成分被洗脱下来，收集洗脱的成分，进行接下来的验证。
[0044]实施例3纯化产物鉴定
[0045]a)SDS
‑
PAGE电泳
[0046]将上述PIC的洗脱与洗杂液进行SDS
‑
PAGE鉴定：分离胶12％、浓缩胶4％(还原)；PIC电泳分离胶7.5％、浓缩胶4％(非还原)；
[0047]结果如下图3，其中泳道1为添加了试剂a之后，洗脱的杂质，M为maker，泳道2为添加了试剂b之后洗脱的PIC。结果表明，试剂a的加入将结合松散的杂蛋白洗脱出来了，而试剂b的加入洗脱的是相对分子量为140ku左右的蛋白，经活性鉴定此蛋白是PIC(Sysmex PIC检测试剂盒(化学发光法)，将试剂b洗脱的组分稀释10倍检测浓度值超过其检测范围上线40μg/mL)。
[0048]b)纯度验证
[0049]将PIC洗脱组分经分光光度计定量，PIC的含量以其280nm消光系数A_280^(1％)＝12.20计算。将PIC分别稀释10倍、100倍、1000倍，采用HISCL自动分析仪测定其含量；
[0050]实施例4层析条件本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.制备高纯度PIC的试剂，其特征在于，包括试剂a和b，所述试剂a含有：0.1
‑
1mol/L NaCl，所述试剂b含有：1
‑
100mmol/L EACA。2.如权利要求1所述的制备高纯度PIC的试剂，其特征在于，所述试剂b含有1
‑
40mmol/L EACA。3.如权利要求1或2所述的制备高纯度PIC的试剂所述试剂，其特征在于，还包括前处理试剂，所述前处理试剂含有100
‑
300μg/mL的尿激酶。4.如权利要求3所述的制备高纯度PIC的试剂所述试剂，其特征在于，所述尿激酶为200μg/mL。5.一种制备高纯度PIC的方法，其特征在于，所述方法为亲和层析，包括以下步骤：(a)上样；(b)润洗亲和柱；(c)加入a，洗脱杂质；(d)加入b，洗脱PIC；其中，所述步骤(b)中，润洗亲和柱的溶液为：0.05mol/L ...

【专利技术属性】
技术研发人员：周帅辉，杨闪，
申请(专利权)人：重庆中元汇吉生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：