用于多重拷贝数变异检测和等位基因比率定量的定量扩增子测序制造技术

本文提供了定量扩增子测序的方法，用于通过聚合酶链式反应用寡核苷酸条形码序列标记DNA样品中靶定基因组基因座的每条链，并扩增用于高通量测序的基因组区域。通过定量每个基因的额外拷贝的频率，这些方法可用于同时检测一组目标基因中的拷贝数变异(CNV)。此外，这些方法使用多重PCR对靶定基因组基因座的不同遗传同一性的等位基因比率进行定量。此外，这些方法提供了突变检测和变体等位基因频率的定量。量。量。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于多重拷贝数变异检测和等位基因比率定量的定量扩增子测序
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2019年1月4日提交的美国临时申请号62/788,375的优先权权益，该申请的全部内容通过引用并入本申请。
[0003]关于联邦政府赞助的研究的声明
[0004]本专利技术是在美国国立卫生研究院授予的政府拨款号R01HG008752的支持下完成的。政府对这项专利技术享有一定的权利。
[0005]序列表的参考
[0006]本申请包含序列表，该序列表已通过EFS
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WEB以ASCII格式提交，并且在此以其全部内容通过引用并入。所述ASCII副本创建于2019年11月26日，命名为RICEP0058WO_ST25.TXT，大小为145.6KB。


[0007]本专利技术总体上涉及分子生物学和医学领域。更具体地，它涉及使用定量扩增子测序，进行多重拷贝数变异检测和等位基因比率定量的组合物和方法。

技术介绍

[0008]拷贝数变异(CNV)是重要的癌症生物标志物，导致癌症的形成和进展。它们存在于很大比例的肿瘤中，根据癌症类型介于3％到98％之间。许多CNV赋予靶定疗法敏感性或抗性，例如，MET扩增使得对非小细胞肺癌中MET TKI的敏感性增加，而PTEN缺失赋予黑色素瘤中的BRAF抑制剂抗性。在肿瘤样品中，由于肿瘤异质性和正常细胞污染，特定基因的CNV可能仅存在于一小部分(＜10％)细胞中。
[0009]与突变和插入缺失不同，CNV没有唯一序列，因此检测CNV需要准确定量。由于DNA分子采样的随机性，这种定量很困难。例如，每个基因座采样1200个分子(即来自600个正常细胞的1200个单倍体基因组拷贝，4ng基因组DNA)的标准偏差(σ)可以通过泊松分布估计：细胞的1200个单倍体基因组拷贝，4ng基因组DNA)的标准偏差(σ)可以通过泊松分布估计：对应分子数量的3％。在这种情况下，不可能检测到1％的额外拷贝。理论上，增加输入分子的数量或分析更多的基因座可以同样降低方差，并且σ可以估计为如果基因组拷贝数或基因座数增加100倍，σ将减少到0.3％，并且可以检测到1％的额外拷贝。
[0010]目前分子诊断中CNV检测的标准方法是原位杂交(ISH)，它可以基于对少量细胞的观察来确定CNV状态。然而，由于荧光和明视野显微镜中可区分的颜色数量有限，ISH技术缺乏同时分析多个基因组区域的能力。此外，ISH是一个复杂的过程，需要由专门的实验室执行，因此无法被广泛采用。
[0011]CNV检测的另一种方法是液滴数字PCR(ddPCR)，这是一种基于PCR的DNA分子绝对定量方法。然而，通过大量重复实验，它对CNV的检测限(LoD)是大约20％的额外拷贝。与ISH
一样，由于荧光通道数量有限，ddPCR也无法进行多重检测。基于微阵列的方法，包括阵列比较基因组杂交和SNP阵列，是用于筛选大型CNV和非整倍体的高度多重检测方法。然而，它们在检测＜40kb的较小CNV或额外拷贝＜30％的低频CNV方面表现不佳。
[0012]下一代测序(NGS)是一种高通量技术，在过去十年中成本迅速降低。NGS在癌症分子诊断领域很受欢迎。已在NGS平台上实现并商业化了LoD＜0.1％变体等位基因频率的高度多重突变检测。然而，当前用于CNV检测的NGS方法的LoD并不那么好：全外显子组测序(WES)已用于额外拷贝的水平约为30％的CNV发现，但价格昂贵，并且需要更多的NGS读段(成本成比例增加)以实现更低的LoD。较小的杂交捕获组合(panel)，例如FoundationOne商业组合，可以以较低的成本达到约30％的额外拷贝的LoD。
[0013]在用于诊断的NGS组合中，需要富集靶标以减少在无关基因组区域上浪费的NGS读段。两种流行的靶标富集方法是杂交捕获和多重PCR。当前基于NGS的CNV组合大多基于杂交捕获，这意味着靶标区域由生物素化核酸探针捕获，并使用链霉亲和素磁珠与基因组的其余部分分离。当组合尺寸较小时，杂交捕获组合的在靶率较低，因此大多数组合＞100kb(即＞1000个探针或基因座)；这是由于不想要的DNA在珠子表面、探针和捕获的靶标上发生非特异性结合。由于基因座数量众多，杂交捕获组合的覆盖率并不统一：95％和5％的百分位基因座相差至少30倍，这在定量中引入了另一层偏差。由于末端修复和连接不完善，杂交捕获组合还存在转化率低(即测序输入分子的百分比)的问题，从而导致采样处理有偏差并导致变异。

技术实现思路

[0014]本文提供了定量扩增子测序的方法，用于通过聚合酶链式反应用寡核苷酸条形码序列标记DNA样品中靶定基因组基因座的每条链，并扩增用于高通量测序的基因组区域。通过定量每个基因的额外拷贝的频率，这些方法可用于同时检测一组目标基因中的拷贝数变异(CNV)。此外，这些方法使用多重PCR对靶定基因组基因座的不同遗传同一性的等位基因比率进行定量。
[0015]在一个实施例中，本文提供了用于制备用于高通量测序的基因组DNA靶定区域的方法，该方法包括：(a)获取基因组DNA样品；(b)通过使用如下进行两个PCR循环来扩增至少一部分基因组DNA样品：(i)第一寡核苷酸，其从5
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到3
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包括第一区域、长度为0至50个核苷酸的第二区域(例如，0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸)、包含至少四个简并核苷酸的第三区域(例如，4、5、6、7、8、9、10、11或12个简并核苷酸)、以及包含与第一靶标基因组DNA区域互补的序列的第四区域；以及(ii)第二寡核苷酸，其从5
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至3
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包括第五区域、长度为0至50个核苷酸的第六区域(例如，0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸)和以及包含与第二靶标基因组DNA区域互补的序列的第七区域；(c)使用比步骤(b)中所使用的退火温度高0
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7℃或其中可导出的任何范围或值)的退火本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于制备用于高通量测序的基因组DNA的靶定区域的方法，所述方法包括：(a)获取基因组DNA样品；(b)通过使用如下项进行两个PCR循环来扩增所述基因组DNA样品的至少一部分：(i)第一寡核苷酸，其从5
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到3
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包括第一区域、长度为0至50个核苷酸的第二区域、包含至少四个简并核苷酸的第三区域、和包含与第一靶标基因组DNA区域互补的序列的第四区域；和(ii)第二寡核苷酸，其从5
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到3
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包括第五区域、长度为0至50个核苷酸的第六区域、和包含与第二靶标基因组DNA区域互补的序列的第七区域；(c)使用比步骤(b)中所使用的退火温度高0
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10℃的退火温度，并使用如下项进行至少三个PCR循环来扩增步骤(b)的产物：(i)第三寡核苷酸，其包括能够与所述第一区域的至少一部分的反向互补序列杂交的序列；和(ii)第四寡核苷酸，其包括能够与所述第五区域的至少一部分的反向互补序列杂交的序列；以及(d)通过使用第五寡核苷酸进行至少一个PCR循环来扩增步骤(c)的产物，所述第五寡核苷酸从5
′
到3
′
包括第八区域、长度为0至50个核苷酸的第九区域、和包含与第三靶标基因组DNA区域互补的序列的第十区域，其中所述第三靶标基因组DNA区域比所述第二靶标基因组DNA区域更靠近所述第一靶标基因组DNA区域至少一个核苷酸。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法是用于制备用于高通量测序的基因组DNA的1至10,000个靶定区域的方法。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述第三区域是唯一分子标识符(UMI)。4.根据权利要求1
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3中任一项所述的方法，其中所述第三靶标基因组DNA区域比所述第二靶标基因组DNA区域更靠近所述第一靶标基因组DNA区域1
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10个碱基。5.根据权利要求1
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4中任一项所述的方法，其中所述第一区域和所述第八区域是通用引物结合位点。6.根据权利要求1
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5中任一项所述的方法，其中所述第一区域和所述第八区域包含完整或部分NGS衔接子序列。7.根据权利要求1
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6中任一项所述的方法，其中所述第五区域包含在人类基因组中找不到的序列。8.根据权利要求1
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7中任一项所述的方法，其中所述第五区域包含不同于NGS衔接子序列的序列。9.根据权利要求1
‑
8中任一项所述的方法，其中所述第一区域和所述第五区域的解链温度比所述第四区域和所述第七区域的解链温度高0
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10℃。10.根据权利要求1
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9中任一项所述的方法，其中所述第三区域中的所述简并核苷酸各自独立地为A、T或C之一。11.根据权利要求1
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10中任一项所述的方法，其中所述第三区域中的所述简并核苷酸均不是G。12.根据权利要求1
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11中任一项所述的方法，其中存在各自具有唯一第三区域的第一寡核苷酸群体。
13.根据权利要求1
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12中任一项所述的方法，其进一步包括纯化步骤(c)的所述产物。14.根据权利要求13所述的方法，其中纯化包括SPRI纯化或柱纯化。15.根据权利要求1
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14中任一项所述的方法，其进一步包括纯化步骤(d)的所述产物。16.根据权利要求15所述的方法，其中纯化包括SPRI纯化或柱纯化。17.根据权利要求1
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16中任一项所述的方法，其进一步包括：(e)使用与所述第一区域和所述第八区域杂交的引物通过PCR来扩增步骤(d)的所述产物，其中所述引物包括用于下一代测序的索引序列。18.根据权利要求17所述的方法，其进一步包括纯化步骤(e)的所述产物。19.根据权利要求18所述的方法，其中纯化包括SPRI纯化或柱纯化。20.根据权利要求17
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19中任一项所述的方法，其进一步包括：(f)对步骤(e)的所述产物进行高通量DNA测序。21.根据权利要求20所述的方法，其中高通量DNA测序包括下一代测序。22.根据权利要求1
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21中任一项所述的方法，其中所述第一靶标基因组DNA区域和所述第二靶标基因组DNA区域在基因组DNA的相反的链上。23.根据权利要求1
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22中任一项所述的方法，其中所述第一靶标基因组DNA区域和所述第二靶标基因组DNA区域相隔40个核苷酸至500个核苷酸。24.根据权利要求1
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23中任一项所述的方法，其中步骤(b)包括约30分钟的延伸时间。25.根据权利要求1
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24中任一项所述的方法，其中步骤(c)包括约30秒的延伸时间。26.根据权利要求1
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25中任一项所述的方法，其中步骤(d)包括约30分钟的延伸时间。27.一种用于定量至少一个靶标基因的额外拷贝的频率(FEC)的方法，所述方法包括：(a)获取基因组DNA样品；(b)根据权利要求1
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26中任一项所述的方法制备所述用于高通量测序的基因组DNA，其中所述第四区域、所述第七区域和所述第十区域的序列与所述至少一个靶标基因杂交；(c)根据权利要求20所述的方法进行高通量测序；和(d)基于步骤(c)中获得的测序信息计算所述至少一个靶标基因的所述FEC。28.根据权利要求27所述的方法，其中所述方法是用于定量一组靶标基因的所述FEC的方法，其中所述一组靶标基因包括2至1000个靶标基因。29.根据权利要求27或28所述的方法，其中使用第一寡核苷酸群体、第二寡核苷酸群体和第五寡核苷酸群体进行步骤(b)，其中第一、第二和第五寡核苷酸群体中的每个群体的一部分分别包含与所述一组靶标基因中的一个互补的第四、第七和第十区域。30.根据权利要求27
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29中任一项所述的方法，其中所述第四、第七和第十区域中的每个包含在人类基因组中仅发现一次的序列。31.根据权利要求27
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30中任一项所述的方法，其中与一个靶标基因杂交的每个第一寡核苷酸和与相同靶标基因杂交的每个其他第一寡核苷酸相比，具有唯一第三区域。...

【专利技术属性】
技术研发人员：大卫，
申请(专利权)人：威廉马歇莱思大学，
类型：发明
国别省市：