DNA扩增反应中的不可延伸的寡核苷酸制造技术

本文提供了不可延伸的寡核苷酸，用于通过合理设计的在3

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】DNA扩增反应中的不可延伸的寡核苷酸
[0001]对相关申请的引用
[0002]本申请要求2021年3月2日提交的美国临时申请号63/155,398和2020年5月27日提交的美国临时申请号63/030,452的优先权，所述美国临时申请中的每一个的全部内容通过引用并入本文。
[0003]关于联邦资助研究的声明
[0004]本专利技术是在美国国立卫生研究院授予的授权号R01CA203964下在政府资助的情况下完成的。政府享有本专利技术中的某些权利。
[0005]对序列表的引用
[0006]本申请含有已经以ASCII格式经由EFS
‑
Web递交的序列表并且所述序列表据此通过引用整体并入。于2021年5月18日创建的所述ASCII副本被命名为RICEP0076WO_ST25.txt并且大小为55.3千字节。

技术介绍

[0007]此公开的开发部分在授权号RP180147下由德克萨斯州癌症预防和研究所(CPRIT)资助。
1.

[0008]本专利技术总体上涉及分子生物学领域。更具体地说，本专利技术涉及包括不可延伸的寡核苷酸(NEO)的组合物和使用该不可延伸的寡核苷酸的方法，该不可延伸的寡核苷酸在其3
′
端处或附近具有合理设计的二级结构，其不被具有3
′‑
＞5
′
核酸外切酶活性的高保真度DNA聚合酶酶促延伸。
[0009]2.相关技术描述
[0010]DNA聚合酶用于各种应用中，以延伸DNA寡核苷酸。然而，存在某些情况，其中希望含有DNA聚合酶的溶液中的某些DNA寡核苷酸不被酶促延伸。历史上，研究人员已经使用在3
′
端具有化学修饰的DNA寡核苷酸来防止酶促的延伸；这些修饰包含反向DNA核苷酸、聚乙二醇间隔子、基于烷烃的间隔子、荧光团、猝灭剂、小沟结合剂等。这些化学修饰在寡核苷酸合成后对DNA寡核苷酸进行功能化是昂贵的，显著降低了寡核苷酸的纯度和产量，并显著延长了合成周转时间。由于这些原因，需要未被化学修饰的不可延伸的寡核苷酸。

技术实现思路

[0011]因此，本文提供了不可延伸的寡核苷酸(NEO)，其通过合理设计的NEO的3
′
端处的二级结构抑制酶促延伸。
[0012]在一个实施例中，本文提供了组合物，所述组合物包括DNA模板、DNA聚合酶和不可延伸的寡核苷酸，其中所述DNA模板从5
′
至3
′
连续地包括上游序列和探针结合序列，其中所述不可延伸的寡核苷酸从5
′
至3
′
包括：结合序列，所述结合序列与所述DNA模板的所述探针结合序列的反向互补序列至少70％相同，终止子发夹，所述终止子发夹位于不可延伸的寡
核苷酸的3
′
端，所述终止子发夹包括：第一茎序列，第二茎序列，其中所述第二茎序列是所述第一茎序列的反向互补序列，以及环序列，所述环序列位于所述第一茎序列和所述第二茎序列之间。例如，所述结合序列与所述DNA模板的所述探针结合序列的反向互补序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同。
[0013]在一些方面，所述不可延伸的寡核苷酸的所述结合序列为10至300个核苷酸长。例如，所述不可延伸的寡核苷酸的所述结合序列可以为10
‑
300、10
‑
250、10
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200、10
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150、10
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100、10
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90、10
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80、10
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70、10
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60、10
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50、10
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45、10
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40、10
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35、10
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30、15
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30、15
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35、15
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40、15
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45、15
‑
50、20
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35、20
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40、20
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45或20
‑
50个核苷酸长。例如，所述不可延伸的寡核苷酸的所述结合序列可以为至少或约10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280或300个核苷酸长。
[0014]在一些方面，所述不可延伸的寡核苷酸的所述终止子发夹不是所述DNA模板的所述上游序列的反向互补序列。在一些方面，所述不可延伸的寡核苷酸的所述终止子发夹不能与所述DNA模板的所述上游序列杂交。
[0015]在一些方面，所述终止子发夹的所述第一茎序列为3至8个核苷酸长。例如，所述终止子发夹的所述第一茎序列可以为至少或约3、4、5、6、7或8个核苷酸长。在一些方面，所述终止子发夹的所述第一茎序列为四个核苷酸长。在一些方面，所述终止子发夹的所述第二茎序列为3至8个核苷酸长。例如，所述终止子发夹的所述第二茎序列可以为至少或约3、4、5、6、7或8个核苷酸长。在某些方面，所述终止子发夹的所述第二茎序列为四个核苷酸长。在一些方面，所述终止子发夹的所述第一茎序列和所述第二茎序列均为四个核苷酸长。
[0016]在一些方面，所述终止子发夹具有腺嘌呤核苷酸作为其最3
′‑
核苷酸。在一些方面，所述第一茎序列为5
′‑
TCTC
‑3′
，并且所述第二茎序列为5
′‑
GAGA
‑3′
。在一些方面，所述第一茎序列为5
′‑
GTTC
‑3′
，并且所述第二茎序列为5
′‑
GAAC
‑3′
。
[0017]在一些方面，所述终止子发夹的所述环序列为3至10个核苷酸长。例如，所述终止子发夹的所述环序列可以为至少或约3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸长。在一些方面，所述终止子发夹的所述环序列为四个核苷酸长。在一些方面，所述环序列为5
′‑
GCAA
‑3′
。
[0018]在一些方面，所述不可延伸的寡核苷酸进一步包括位于所述结合序列和所述终止子发夹之间的中间发夹。所述中间发夹可以包括第三茎序列、第四茎序列和第二环序列，所述第二环序列位于所述第三茎序列和所述第四茎序列之间，其中所述第四茎序列是所述第三茎序列的反向互补序列。在一些方面，所述终止子发夹的最3
′‑
核苷酸是胞嘧啶。在一些方面，所述终止子发夹的所述第一茎序列和所述终止子发夹的所述第二茎序列各自为3至8个核苷酸长。例如，所述终止子发夹的所述第一茎序列和所述第二茎序列可以各自独立地为至少或约3、4、5、6、7或8个核苷酸长。在一些方面，所述第一茎序列为5<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种组合物，其包括DNA模板、DNA聚合酶和不可延伸的寡核苷酸，其中所述DNA模板从5
′
至3
′
连续地包括上游序列和探针结合序列，其中所述不可延伸的寡核苷酸从5
′
至3
′
包括：结合序列，所述结合序列与所述DNA模板的所述探针结合序列的反向互补序列至少70％相同，和终止子发夹，所述终止子发夹位于所述不可延伸的寡核苷酸的3
′
端，所述终止子发夹包括：第一茎序列，第二茎序列，其中所述第二茎序列是所述第一茎序列的反向互补序列，和第一环序列，所述第一环序列位于所述第一茎序列和所述第二茎序列之间。2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述不可延伸的寡核苷酸的所述结合序列为10至300个核苷酸长。3.根据权利要求1或2所述的组合物，其中所述不可延伸的寡核苷酸的所述终止子发夹不是所述DNA模板的所述上游序列的反向互补序列。4.根据权利要求3所述的组合物，其中所述不可延伸的寡核苷酸的所述终止子发夹不能与所述DNA模板的所述上游序列杂交。5.根据权利要求1至4中任一项所述的组合物，其中所述终止子发夹的所述第一茎序列为3至8个核苷酸长。6.根据权利要求1至5中任一项所述的组合物，其中所述终止子发夹的所述第一茎序列为四个核苷酸长。7.根据权利要求1至6中任一项所述的组合物，其中所述终止子发夹的所述第二茎序列为3至8个核苷酸长。8.根据权利要求1至7中任一项所述的组合物，其中所述终止子发夹的所述第二茎序列为四个核苷酸长。9.根据权利要求1至8中任一项所述的组合物，其中所述终止子发夹的所述第一茎序列和所述第二茎序列均为4个核苷酸长。10.根据权利要求1至9中任一项所述的组合物，其中所述终止子发夹具有腺嘌呤核苷酸作为其最3
′‑
核苷酸。11.根据权利要求1至10中任一项所述的组合物，其中所述第一茎序列为5
′‑
TCTC
‑3′
，并且所述第二茎序列为5
′‑
GAGA
‑3′
。12.根据权利要求1至9中任一项所述的组合物，其中所述第一茎序列为5
′‑
GTTC
‑3′
，并且所述第二茎序列为5
′‑
GAAC
‑3′
。13.根据权利要求1至12中任一项所述的组合物，其中所述终止子发夹的所述第一环序列为3至10个核苷酸长。14.根据权利要求1至13中任一项所述的组合物，其中所述终止子发夹的所述第一环序列为四个核苷酸长。15.根据权利要求1至14中任一项所述的组合物，其中所述第一环序列为5
′‑
GCAA
‑3′
。16.根据权利要求1至15中任一项所述的组合物，其中所述不可延伸的寡核苷酸进一步包括位于所述结合序列和所述终止子发夹之间的中间发夹，所述中间发夹包括：
第三茎序列，第四茎序列，其中所述第四茎序列是所述第三茎序列的反向互补序列，和第二环序列，所述第二环序列位于所述第三茎序列和所述第四茎序列之间。17.根据权利要求16所述的组合物，其中所述终止子发夹的最3
′‑
核苷酸是胞嘧啶。18.根据权利要求16或17所述的组合物，其中所述终止子发夹的所述第一茎序列和所述终止子发夹的所述第二茎序列各自为3至8个核苷酸长。19.根据权利要求16至18中任一项所述的组合物，其中所述终止子发夹的所述第一茎序列和所述终止子发夹的所述第二茎序列各自为四个核苷酸长。20.根据权利要求16至19中任一项所述的组合物，其中所述第一茎序列为5
′‑
GTTA
‑3′
，并且所述第二茎序列为5
′‑
TAAC
‑3′
。21.根据权利要求16至19中任一项所述的组合物，其中所述第一茎序列为5
′‑
GATT
‑3′
，并且所述第二茎序列为5
′‑
AATC
‑3′
。22.根据权利要求16至21中任一项所述的组合物，其中所述中间发夹的所述第三茎序列和所述中间发夹的所述第四茎序列各自为3至20个核苷酸长。23.根据权利要求16至22中任一项所述的组合物，其中所述中间发夹的所述第三茎序列和所述中间发夹的所述第四茎序列各自为六个核苷酸长。24.根据权利要求16至23中任一项所述的组合物，其中所述第三茎序列为5
′‑
GAGAAC
‑3′
，并且所述第四茎序列为5
′‑
GTTCTC
‑3′
。25.根据权利要求16至23中任一项所述的组合物，其中所述第三茎序列为5
′‑
CCTGTA
‑3′
，并且所述第四茎序列为5
′‑
TACAGG
‑3′
。26.根据权利要求16至25中任一项所述的组合物，其中所述终止子发夹的所述第一环序列为3至10个核苷酸长。27.根据权利要求16至26中任一项所述的组合物，其中所述终止子发夹的所述第一环序列为四个核苷酸长。28.根据权利要求16至27中任一项所述的组合物，其中所述第一环序列为5
′‑
GCAA
‑3′
。29.根据权利要求16至28中任一项所述的组合物，其中所述中间发夹的所述第二环序列为3至15个核苷酸长。30.根据权利要求16至29中任一项所述的组合物，其中所述中间发夹的所述第二环序列为四个核苷酸长。31.根据权利要求16至30中任一项所述的组合物，其中所述中间发夹的所述第二环序列为5
′‑
ATTA
‑3′
。32.根据权利要求16至30中任一项所述的组合物，其中所述中间发夹的所述第二环序列为5
′‑
CACA
‑3′
。33.根据权利要求1至32中任一项所述的组合物，其中所述不可延伸的寡核苷酸进一步包括位于所述结合序列和所述终止子发夹之间的错配序列。34.根据权利要求33所述的组合物，其中所述错配序列为1至100个核苷酸长。35.根据权利要求33或34所述的组合物，其中所述错配序列与所述DNA模板的所述上游序列的反向互补序列至多30％相同。36.根据权利要求35所述的组合物，其中所述错配序列不能与所述DNA模板的所述上游
序列杂交。37.根据权利要求33至36中任一项所述的组合物，其中所述错配序列不形成非线性二级结构。38.根据权利要求33至37中任一项所述的组合物，其中所述错配序列不形成发夹。39.根据权利要求37或38所述的组合物，其中所述错配序列为5至20个核苷酸长。40.根据权利要求33至36中任一项所述的组合物，其中所述错配序列包括前一子序列和后一子序列，其中所述后一子序列是所述起前一子序列的反向互补序列。41.根据权利要求40所述的组合物，其中所述前一子序列和所述后一子序列各自为至少四个核苷酸长。42.根据权利要求40或41所述的组合物，其中所述前一子序列和后一子序列各自为六个核苷酸长。43.根据权利要求40至42中任一项所述的组合物，其中所述错配序列包括多个前一子序列和多个后一子序列，其中每个前一子序列是相应的后一子序列的反向互补序列。44.根据权利要求43所述的组合物，其中每个前一子序列和每个后一子序列为至少四个核苷酸长。45.根据权利要求43或44所述的组合物，其中所述错配序列从5
′
至3
′
包括第一子序列、第二子序列、第三子序列和第四子序列，其中所述第一子序列是所述第二子序列的反向互补序列，并且其中所述第三子序列是所述第四子序列的反向互补序列。46.根据权利要求45所述的组合物，其中所述第一子序列、所述第二子序列、所述第三子序列和所述第四子序列中的每一个为四至15个核苷酸长。47.根据权利要求43或44所述的组合物，其中所述错配序列从5
′
至3
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...

【专利技术属性】
技术研发人员：大卫，
申请(专利权)人：威廉马歇莱思大学，
类型：发明
国别省市：