一种血液样本中病原菌DNA的制备方法和基于此方法的临床病原菌感染诊断试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种血液样本中病原菌DNA的制备方法和基于此方法的临床病原菌感染诊断试剂盒。所述方法包括：(a)将血液样本与足量的皂素Saponin充分混合，(b)待血液样本由浑浊变透明后，离心富集病原菌，弃掉上清；(c)离心沉淀中加入叠氮溴化丙锭PMA溶液，震荡重悬，避光孵育，然后亮处光解；(d)按照常规DNA提取方法从光解后混合物中分离制备病原菌DNA。本发明专利技术利用血液样本中病原菌细胞和非病原菌细胞的胞壁结构差异，裂解并去除非病原菌DNA，提高了病原菌检测的灵敏度和稳定性。病原菌检测的灵敏度和稳定性。病原菌检测的灵敏度和稳定性。

【技术实现步骤摘要】
一种血液样本中病原菌DNA的制备方法和基于此方法的临床病原菌感染诊断试剂盒


[0001]本专利技术属于病原菌感染的分子诊断学领域，具体涉及一种血液样本中病原菌DNA的制备方法和基于此方法的临床病原菌感染诊断试剂盒。

技术介绍

[0002]临床微生物学实验室目前用于鉴定病人系统性感染常用的标准方法是血培养。然而，由于血中病原菌数量过少而导致血培养方法的灵敏度非常低下，甚至有些细菌是不可培养型的，无法在体外培养生长。另外，血培养方法周期长，通常需要3—7天的时间才有可能得到结果，极大的延误对致病菌的精准定性和对病人的有效用药，从而加速耐药菌的形成。
[0003]近年来，荧光定量PCR(QPCR)技术在传染性疾病的分子诊断领域逐渐得到广泛的应用。理论上讲，QPCR反应方法对病原微生物的检测既特异灵敏又快速便捷。然而，从实际操作来看，这些以PCR为基础的诊断方法目前还没有显示出比血培养方法有更大的优越性，甚至还不如传统的血培养方法有效。其主要原因之一是临床样本中含有大量的宿主DNA，这些宿主DNA的存在严重的干扰了QPCR方法的特异性和灵敏度。
[0004]QPCR诊断方法的专一性和灵敏度在很大程度上取决于检测样品DNA的提取方法。目前的常规核酸提取试剂盒用于提取临床样本中DNA的时候区分不开宿主DNA和病原菌DNA。因此，所得的DNA实质上是病原菌DNA和宿主DNA(如人血液细胞DNA)的混合物。而病原菌DNA的占比非常小，这极大的降低了QPCR的灵敏度。另外，用于检测病原菌的引物可能会与宿主DNA非特异性结合，导致假阳性或者假阴性结果的出现。临床样本中提取的DNA中病原菌DNA的占比越小，则产生假阳性或者假阴性结果的可能性越大。
[0005]通常用于病原菌鉴定的临床血液样本中存在的病原菌数量极少，如某些血流感染患者的血液样本中细菌含量仅有约10CFU/ml。从这样的临床样本中制备的DNA仅有痕量的病原菌DNA分子，而绝大多数的DNA都是宿主DNA。临床分子诊断的目标就是要求从这样的样品中检测证明是否有病原菌DNA的存在，从而准确无误的做出诊断结果(鉴定导致感染的病原菌)。占绝大多数的宿主DNA在临床样本中的存在，给QPCR反应在传染性疾病诊断上的应用带来了严峻的困难和挑战。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是提供一种能从临床血液样本中有效去除宿主血细胞DNA，富集病原菌DNA的制备方法。利用本方法制备的DNA进行QPCR反应，能尽量避免占绝大多数的宿主DNA对QPCR检测病原菌的干扰，在很大程度上提高了PCR反应的特异性和灵敏度。
[0007]本专利技术提供的一种临床血液样本中病原菌DNA的制备方法，包括以下步骤：
[0008](a)将临床血液样本与足量的皂素Saponin充分混合，血液样本中的非病原菌细胞被Saponin裂解；
[0009](b)待血液样本由浑浊变透明后，离心富集病原菌，弃掉上清；
[0010](c)离心沉淀中加入叠氮溴化丙锭(PMA)溶液，震荡重悬，避光孵育，然后亮处光解；
[0011](d)按照常规DNA提取方法从光解后混合物中分离制备病原菌DNA。
[0012]进一步，所述步骤(a)中皂素Saponin先溶于水，再跟临床血液样本混合。
[0013]进一步，所述步骤(a)中皂素Saponin在所述混合体系中的质量百分比浓度为0.1％
‑
0.5％，裂解温度为室温，裂解时间为30min。
[0014]或者，所述步骤(a)中皂素Saponin在所述混合体系中的质量百分比浓度为1％
‑
2％，裂解温度为室温，裂解时间为5
‑
10min。
[0015]进一步，所述步骤(a)中皂素Saponin在混合体系中的质量百分比浓度为1％
‑
2％，在室温下置于Hula mixer上孵育5min完成裂解。
[0016]进一步，所述步骤(b)中待血液样本由浑浊变透明后，加入等体积5M的NaCl溶液翻转混匀，室温下孵育1分钟后，20000
×
g离心15
‑
20分钟富集病原菌，弃掉上清，将沉淀用PBS缓冲液重悬。
[0017]其中加入NaCl是为了增加宿主细胞裂解后DNA的溶解度，防止其析出而沉淀，另一个作用是稀释溶液，使病原菌更容易沉淀。
[0018]进一步，所述步骤(c)中PMA溶液加入后的终浓度为10
‑
20μM，光解时间为25min。
[0019]或者，所述步骤(c)中PMA溶液加入后的终浓度为50μM，光解时间为5min。
[0020]进一步，所述步骤(c)中震荡重悬混匀后的样品，室温避光孵育2
‑
10min后，在465
‑
475nm的特定光源曝光5
‑
30min,光源距离样品管10
‑
20cm,曝光期间样品经常轻柔震荡混匀。
[0021]所述特定光源采用PMA
‑
Lite
TM LED Photolysis Device发光二极管光解装置发射。
[0022]进一步，所述步骤(c)中光解之后的样品20000
×
g离心15min，弃掉上清，用PBS重悬，然后按照常规方法提取DNA。
[0023]所述常规DNA提取方法是采用Pathogen Kit(Qiagen,SP54104)提取DNA。
[0024]本专利技术还提供一种临床血液样本中病原菌DNA提取试剂盒，所述试剂盒包括Saponin溶液、叠氮溴化丙锭(PMA)溶液和常规DNA提取试剂。
[0025]本专利技术还提供一种临床病原菌感染诊断试剂盒，所述试剂盒包括Saponin溶液，叠氮溴化丙锭(PMA)溶液，常规DNA提取试剂盒、QPCR反应试剂和病原菌特异检测引物。
[0026]临床样本中的病原菌指的是耐Saponin和PMA的致病细菌，主要来源于以下属种：不动杆菌属(Acinetobacter)，拟杆菌属(Bacteroides)，柠檬酸细菌属(Citrobacter)，肠杆菌属(Enterobacter)，大肠杆菌(Escherichia coli)，梭形杆菌(Fusobacterium)，流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)，克雷伯菌属(Klebsiella)，分支杆菌(Mycobacterium)，卟啉单胞菌(Porphyromonas)，普氏菌属(Prevotella)，变形杆菌(Proteus)，假单胞菌(Pseudomonas)，沙门氏菌(Salmonella)，志贺氏菌属(Shigella)，肠球菌(Enterococcus)。
[0027]根据上述致病菌，本领域技术人员可以按照常规知识设计其特异性引物，再以本
专利技术的制备方法获得的致病菌DNA为模板进行QPCR反应，检测样品中是否含有上述致病菌。
[0028]本发本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种血液样本中病原菌DNA的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(a)将血液样本与足量的皂素Saponin充分混合，血液样本中的非病原菌细胞被Saponin裂解；(b)待血液样本由浑浊变透明后，离心富集病原菌，弃掉上清；(c)离心沉淀中加入叠氮溴化丙锭PMA溶液，震荡重悬，避光孵育，然后亮处光解；(d)按照常规DNA提取方法从光解后混合物中分离制备病原菌DNA。2.根据权利要求1所述病原菌DNA的制备方法，其特征在于，所述步骤(a)中皂素Saponin先溶于水，再跟临床血液样本混合。3.根据权利要求1所述病原菌DNA的制备方法，其特征在于，所述步骤(a)中皂素Saponin在所述混合体系中的质量百分比浓度为0.1％
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0.5％，裂解温度为室温，裂解时间为30min。4.根据权利要求1所述病原菌DNA的制备方法，其特征在于，所述步骤(a)中皂素Saponin在所述混合体系中的质量百分比浓度为1％
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2％，裂解温度为室温，裂解时间为5
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10min。5.根据权利要求1所述病原菌DNA的制备方法，其特征在于，所述步骤(b)中待血液样本由浑浊变透明后，加入等体积5M的NaCl溶液...

【专利技术属性】
技术研发人员：张磊，刘鹏，张省委，黄文华，江华，律清宇，郑玉玲，姜永强，王叶，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事科学院军事医学研究院，
类型：发明
国别省市：