一种利用囊胚培养液检测胚胎染色体异常的方法技术

本发明专利技术涉及一种利用囊胚培养液检测胚胎染色体异常的方法，通过从胚胎早期体外培养液即囊胚培养液中检测胚胎来源的游离DNA，对微量DNA进行均匀的全基因组扩增，再利用二代测序等方法对扩增后的DNA产物进行分析，从而判断胚胎的染色体情况，即是否出现染色体整体或局部的非整倍体。本发明专利技术选择囊胚培养液这种体外受精操作过程中胚胎体外培养阶段的废弃物作为检测样本，这种非侵入性无创的方法既避免了常规卵裂球活检或囊胚滋养层细胞活检取样时对胚胎造成的细胞损伤，又不给临床增添额外的麻烦，同时简化了样本获取时的操作，安全可靠性及简便性更高。靠性及简便性更高。靠性及简便性更高。

【技术实现步骤摘要】
Gianaroli,M.Cristina Magli,Alessandra Pomante,et al.Blastocentesis:a source of DNA for preimplantation genetic testing.Results from a pilot study.Fertility and Sterility,2014,102(6):1692
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1698.)。然而，囊胚腔液是囊胚腔中的液体，欲获取囊胚腔液仍需要在囊胚上打洞或刺穿，其介入性仍会对胚胎造成不可避免的损伤。
[0007]综上所述，现有技术所存在的主要缺点为：
[0008]1.细胞取样时对胚胎操作技术要求较高，如果操作失误、粗暴操作会导致胚胎严重损伤，损伤过于严重可造成胚胎发育终止。
[0009]2.即使良好操作，细胞取样时不可避免地对胚胎造成细胞损失和轻微损伤。尽管现在尚无证据表明细胞损失和轻微损伤会对胚胎发育和出生后健康发生不良影响，但该技术出现的时间尚短(仅数年)，其对人的终生健康是否存在远期影响仍然有待观察。
[0010]3.在少数情况下，存在取样获得的几个细胞的染色体状态与胚胎中其它细胞的染色体状态不同的情况，导致检测结果失误。
[0011]因此，一种不损伤胚胎本身，而又可以对胚胎染色体状况进行检查的非侵入性的技术手段，是消除健康影响隐患、确保胚胎检测安全性的现实需求。

技术实现思路

[0012]本专利技术的目的就是针对上述现有技术中的不足，提供一种利用囊胚培养液检测胚胎染色体异常的方法，其不会对胚胎带来任何损伤，操作简单，安全性和可靠性更高。
[0013]为了实现上述目的，本专利技术提供了一种利用囊胚培养液检测胚胎染色体异常的方法，其包括如下步骤：
[0014](1)囊胚培养液的获得：通过单精子注射方法获得受精卵，将其培养至第3天卵裂球期之后转移至新制备的囊胚培养微滴中进行囊胚培养，此时在第3天进行换液是必须的，目的是去除脱落的颗粒细胞及未受精精子的污染；
[0015]将形成囊胚的胚胎吸出，转移至新的囊胚培养液中或者进入玻璃化冻存流程，剩余的原囊胚培养液约1微升至500微升，优选10微升至200微升，即为进行胚胎植入前遗传学筛查(PGS)需要收集的样本；
[0016](2)囊胚培养液的采集：将步骤(1)中获取的原囊胚培养液转移至裂解液中，离心后，样本进入下一步的全基因组扩增步骤；
[0017](3)囊胚培养液中微量DNA的全基因组扩增：向步骤(2)中获得的囊胚培养液与裂解液的混合物中加入裂解酶，混匀后孵育，而后使裂解酶失活，取出裂解产物加入PCR反应管中进行PCR反应；
[0018](4)将全基因组扩增后的DNA产物进行分析，以鉴定胚胎的染色体状态是否正常：分析时采用二代测序、核酸芯片或者免疫荧光检测。
[0019]其中，步骤(2)中裂解液的成分是PH为7.0～8.0的Tris
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Cl 25
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45mM，EDTA 0.5
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3mM，KCl 10
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25mM以及浓度为0.05％
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5％的去污剂，所述去污剂为Triton X
‑
100、Triton X
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114、吐温20、NP40和SDS中的一种或多种。优选地，裂解液的成分为PH为7.2的Tris
‑
Cl 40mM，EDTA 1mM，KCl 15mM以及3％的Triton X
‑
100。
[0020]步骤(3)中的裂解酶选自蛋白酶K、Qiagen Protease、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋
白酶和溶菌酶中的一种或多种，所述裂解酶的浓度为1
‑
25μg/ml，优选为20μg/ml；步骤(3)中孵育温度为30
‑
60℃，孵育时间为1min至12h，失活温度为75
‑
95℃，失活时间为1
‑
15min；优选地，孵育温度为40℃，孵育时间为3h，失活温度为90℃，失活时间为5min。
[0021]步骤(3)中进行PCR反应时的PCR反应管中含有扩增混合液、0.5％
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20％的PCR抑制物对抗剂、5
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20mM dNTP、5
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100μM NG和NT引物、50
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200μM扩增引物、0.5
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10单位核酸聚合酶，所述PCR抑制物对抗剂选自DMSO、甜菜碱、甲酰胺、甘油和白蛋白中的一种或多种，所述核酸聚合酶选自Phi29DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶、Vent聚合酶、Deep Vent聚合酶、Klenow Fragment DNA聚合酶I、MMLV反转录酶、AMV反转录酶、HIV反转录酶、超保真DNA聚合酶、Taq聚合酶、E.coli DNA聚合酶、LongAmp Taq DNA聚合酶和OneTaq DNA聚合酶中的一种或多种。
[0022]所述扩增混合液的成分为10
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25mM Tris
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HCl，5
‑
25mM(NH4)2SO4，5
‑
30mM KCl，0.5
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5mM MgSO4，0.1％
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20％DMSO和0.05
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5％Triton X
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100。优选地，所述扩增混合液的成分为15mM Tris
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HCl，15mM(NH4)2SO4，20mM KCl，1mM MgSO4，5％DMSO和2％Triton X
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100。
[0023]所述NG和NT引物从5
’
端到3
’
端包含通用序列和可变序列，其中所述通用序列由G、A、C和T四种碱基中的三种或者两种组成，条件是所述通用序列不同时包括G和C；所述扩增引物包含所述通用序列且不包含所述可变序列。所述可变序列选自下组：(N)nGGG、(N)nTTT，(N)mTNTNG，(N)xGTGG(N)y，其中N为任意的可与天然核酸进行碱基配对的核苷酸，n是选自3
‑
17的正整数，m是选自3
‑
15的正整数，x和y分别是选自3
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13的正整数。
[0024]优选地，所述NG和NT引物包括SEQ ID NO:1[GTGAGTGATGGTTGAGGTAGTGTGGAGNNNNNNNN]、SEQ ID NO:2[GTGAGTGATGGTTGAGGTAGTGTGGAGNNNNNGGG]、SEQ ID NO:3[GTGAGTGATGGTTGAGGTAGTGTGGAGNNNNNTTT]、SEQ ID NO:4[GTGAGTGATGGTTGAGGTAGTGTGGAGNNNTNTNG]或SEQ ID NO:5[GTGAGTGATGGTTGAGGTAGTGTGGAGNNNGTGGN本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用囊胚培养液检测胚胎染色体异常的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)囊胚培养液的获得：通过单精子注射方法获得受精卵，将其培养至第3天卵裂球期之后转移至新制备的囊胚培养微滴中进行囊胚培养，将形成囊胚的胚胎吸出，转移至新的囊胚培养液中或者进入玻璃化冻存流程，剩余的原囊胚培养液即检测时所需要收集的样本；(2)囊胚培养液的采集：将步骤(1)中获取的原囊胚培养液转移至裂解液中，离心后，样本进入下一步的全基因组扩增步骤；(3)囊胚培养液中微量DNA的全基因组扩增：向步骤(2)中获得的囊胚培养液与裂解液的混合物中加入裂解酶，混匀后孵育，而后使裂解酶失活，取出裂解产物加入PCR反应管中进行基因组扩增反应；(4)将全基因组扩增后的DNA产物进行分析，以鉴定胚胎的染色体状态是否正常：分析时采用二代测序、核酸芯片或者免疫荧光检测。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中裂解液的成分是PH为7.0～8.0的Tris
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Cl 25
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45mM，EDTA 0.5
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3mM，KCl 10
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25mM以及浓度为0.05％
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5％的去污剂，所述去污剂为Triton X
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100、Triton X
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114、吐温20、NP40和SDS中的一种或多种。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，裂解液的成分优选为PH为7.2的Tris
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Cl 40mM，EDTA 1mM，KCl 15mM以及3％的Triton X
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100。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中的裂解酶选自蛋白酶K、Qiagen Protease、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和溶菌酶中的一种或多种，所述裂解酶的浓度为1
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25μg/ml。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述裂解酶的浓度优选为20μg/ml。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中孵育温度为30
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60℃，孵育时间为1min至12h，失活温度为75
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95℃，失活时间为1
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15min。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(3)中优选的，孵育温度为40℃，孵育时间为3h，失活温度为90℃，失活时间为5min。8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中进行PCR反应时的PCR反应管中含有扩增混合液、0.5％
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20％的PCR抑制物对抗剂、5
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20mM dNTP、5
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100μM NG和NT引物、50
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200μM扩增引物、0.5
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10单位核酸聚合酶，所述PCR抑制物对抗剂选自DMSO、甜菜碱、甲酰胺、甘油和白蛋白中的一种或多种，所述核酸聚合酶选自Phi29 DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶、Vent聚合酶、Deep Vent聚合酶、Klenow Fragment DNA聚合酶I、MMLV反转录酶、AMV反转录酶、HIV反转录酶、超保真DNA聚合酶、Taq聚合酶、E.coli DNA聚合酶、LongAmp Taq DNA聚合酶和OneTaq DNA聚合酶中的一种或多种。9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述扩增混合液的成分为10
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25mM Tris
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HCl，5
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25mM(NH4)2SO4，5
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30mM KCl，0.5
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5mM MgSO4，0.1％
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20％DMSO和0.05
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5％Triton X
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100。10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述扩增混合液的成分优选为15mM Tris
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HCl，15mM(NH4)2SO4，20mM KCl，1mM MgS...

【专利技术属性】
技术研发人员：陆思嘉，蔡立义，姚兵，
申请(专利权)人：序康医疗科技苏州有限公司，
类型：发明
国别省市：