利用内参快速准确表征蛋白质相对丰度的方法技术

本发明专利技术涉及利用内参快速准确表征蛋白质相对丰度的方法，代替传统蛋白质谱表征方式，可以利用外源双报告基因系统，将一种报告基因融合待测蛋白质，从而表征其在外泌体中的丰度，再利用另一种报告基因作为内参，测定两种不同报告基因信号值比值，作为待测蛋白质在外泌体中的相对丰度。本发明专利技术的有益效果是：实验方法因为引入内参，可以准确评价待测蛋白质在外泌体中的相对富集程度；检测内源或外源蛋白在靶细胞外泌体中的相对丰度；不需要制备蛋白质组学样本并进行蛋白质组学分析，对实验操作技术水平要求低，实验成本低且周期短，可以用于快速表征分析不同蛋白质的富集或缺失。于快速表征分析不同蛋白质的富集或缺失。于快速表征分析不同蛋白质的富集或缺失。

【技术实现步骤摘要】
利用内参快速准确表征蛋白质相对丰度的方法


[0001]本专利技术属于生物检测领域，尤其是涉及一种利用内参快速准确表征蛋白质相对丰度的方法。

技术介绍

[0002]外泌体(exosomes)是一种直径在30
‑
150nm之间的茶托型结构的小囊泡，包含RNA、蛋白质、microRNA、DNA片段等多种成分。全部真核细胞和一些原核细胞均可分泌，主要分布在血液、唾液、尿液、羊水和母乳等多种体液中。它是由细胞质膜内陷形成早期的核内体，核内体内陷包裹物质形成多泡体，而后多泡体在与质膜融合后得以释放。尽管外泌体早在1983年就被发现，但当时人们普遍认为它是细胞代谢的废弃物，主要作用是在新陈代谢过程中承担扔废料的角色。然而2007年，研究人员发现外泌体含有母细胞来源的蛋白、脂质和核酸，并能作为信号分子传递其他细胞从而改变靶细胞功能。随着研究结果的不断发现，把外泌体研究与转化研究推向了新的时代。
[0003]外泌体表征中蛋白质组学是关键指标，而最常使用的设备是蛋白质质谱分析仪。蛋白质谱样品处理方法复杂，步骤繁多，对实验操作技术水平要求很高，试剂价格昂贵，以Thermo Scientific
TM EasyPep
TM 微型MS样品制备试剂盒说明书为例，该试剂盒目录价格为7023.00元/20次实验，对纯化后样品依次进行细胞裂解，核酸降解，蛋白质酶解，还原/烷基化，肽段纯化富集等操作步骤，此外蛋白质质谱分析仪以及配套软件价格昂贵，使用操作更加复杂，严重影响对外泌体内蛋白质相对丰度的研究，而且不能考察外源蛋白在靶细胞外泌体中的表达丰度。

技术实现思路

[0004]为解决上述技术问题，本专利技术提供一种利用内参快速准确表征蛋白质相对丰度的方法。
[0005]本专利技术采用的技术方案是：利用内参快速准确表征蛋白质相对丰度的方法，在基因能够表达的环境中转入外源基因和待测蛋白基因，外源基因包括第一报告基因和第二报告基因，待测蛋白基因与第一报告基因或第二报告基因连接，表达后，测定第一报告基因和第二报告基因信号比值即为待测蛋白的相对丰度，用于衡量所述待测蛋白基因在所述表达环境中的表达能力。
[0006]优选地，通过对比两种不同待测蛋白的相对丰度从而对两种不同待测蛋白做出比较。
[0007]优选地，待测蛋白为内源蛋白或外源蛋白。
[0008]优选地，待测蛋白基因为外泌体相关基因。
[0009]优选地，待测蛋白为外泌体腔内蛋白、膜上蛋白或膜外蛋白。
[0010]优选地，待测蛋白相对丰度测定方法步骤如下：将含有第一报告基因、第二报告基因和待测蛋白基因的一个或两个质粒转入到靶
细胞中；细胞培养后检测第一报告基因、第二报告基因信号；计算得到待测蛋白相对丰度。
[0011]优选地，第一报告基因和第二报告基因能够表达得到两种不同的荧光蛋白和/或荧光化学分子。
[0012]优选地，第一报告基因和第二报告基因能够表达得到萤火虫荧光素酶、海肾荧光素酶、高斯荧光素酶、NanoLuc荧光素酶、β
‑
半乳糖苷酶、AcGFP1和mCherry中任意两个。
[0013]优选地，通过荧光素酶试剂盒、ELISA或荧光显微镜测定第一报告基因和第二报告基因信号。
[0014]优选地，外源基因连接在待测蛋白基因编码序列的5
’
端或3
’
端，或者外源基因连接在待测蛋白基因编码序列中间。
[0015]优选地，待测蛋白基因与第一报告基因连接，待测蛋白相对丰度为第一报告基因信号比第二报告基因信号的值。
[0016]利用内参快速准确表征蛋白质相对丰度的方法在蛋白质分析技术中的应用。
[0017]本专利技术具有的优点和积极效果是：与传统蛋白质组检测方法比较，本方案对实验操作技术水平要求较低，实验周期短、成本低，用于外泌体相关基因的研究时，不限外泌体来源，不限待测蛋白来源，不限靶细胞来源，不限外泌体溶液纯化方式和纯度，具有较广的检测范围；本方案用于外泌体相关蛋白检测时，能够最大限度保留外泌体样本，低浓度或微量检测也能够获得较佳信号值，检测灵敏度高。
附图说明
[0018]图1是用于表征人类CD81蛋白在人胚胎肾细胞HEK293T细胞外泌体中的相对丰度质粒结构图（psiCHECK
‑2‑
CD81）；图2是psiCHECK
‑2‑
CD81质粒在人胚胎肾细胞HEK293T细胞和上清液中两种报告基因活性；图3是用于表征人类CD63蛋白在人胚胎肾细胞HEK293T细胞外泌体中的相对丰度质粒结构图（psiCHECK
‑2‑
CD63）；图4是psiCHECK
‑2‑
CD63质粒在人胚胎肾细胞HEK293T细胞和上清液中两种报告基因活性；图5是用于表征小鼠CD63蛋白在人胚胎肾细胞HEK293T细胞外泌体中的相对丰度质粒结构图（psiCHECK
‑2‑
mouse
‑
CD81）；图6是psiCHECK
‑2‑
mouse
‑
CD63质粒在人胚胎肾细胞HEK293T细胞和上清液中两种报告基因活性；图7用于表征人类CD81蛋白在人胚胎肾细胞HEK293T细胞外泌体中的相对丰度质粒结构图（pBI
‑
CMV2
‑
CD81
‑
mCherry）；图8是pBI
‑
CMV2
‑
CD81
‑
mCherry质粒在人胚胎肾细胞HEK293T细胞和上清液中两种报告基因（AcGFP1和mCherry）活性；图9是用于表征人类CD63蛋白在人胚胎肾细胞HEK293T细胞外泌体中的相对丰度
质粒结构图（pBI
‑
CMV2
‑
CD63
‑
mCherry）；图10是pBI
‑
CMV2
‑
CD63
‑
mCherry质粒在人胚胎肾细胞HEK293T细胞和上清液中两种报告基因（AcGFP1和mCherry）活性。
具体实施方式
[0019]本专利技术涉及一种利用内参快速准确表征蛋白质相对丰度的方法，代替传统的蛋白质组学分析方法，可以利用外源双报告基因系统，一种报告基因表征待测蛋白在外泌体中的丰度，另一种报告基因作为内参，测定两种不同报告基因信号值比值，作为表征待测蛋白质在外泌体中的相对丰度。构建外源双报告基因系统，在基因能够表达的环境中转入外源基因和待测蛋白基因，外源基因包括第一报告基因和第二报告基因，待测蛋白基因与第一报告基因或第二报告基因连接，外源基因表达后，测定第一报告基因和第二报告基因信号比值即为待测蛋白的相对丰度。利用这样的方法能够快速得知待测蛋白的表达水平，检测周期短，成本低。
[0020]本专利技术某些实施例中，待测蛋白可以为内源蛋白，也可以是外源蛋白。尤其适合外泌体相关蛋白表达水平本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.利用内参快速准确表征蛋白质相对丰度的方法，其特征在于：在基因能够表达的环境中转入外源基因和待测蛋白基因，外源基因包括第一报告基因和第二报告基因，待测蛋白基因与第一报告基因或第二报告基因连接，表达后，测定第一报告基因和第二报告基因信号比值即为待测蛋白的相对丰度，用于衡量所述待测蛋白基因在所述表达环境中的表达能力。2.根据权利要求1所述的利用内参快速准确表征蛋白质相对丰度的方法，其特征在于：对比两种不同待测蛋白的相对丰度从而对两种不同待测蛋白做出比较。3.根据权利要求1或2所述的利用内参快速准确表征蛋白质相对丰度的方法，其特征在于：待测蛋白为内源蛋白或外源蛋白。4.根据权利要求3所述的利用内参快速准确表征蛋白质相对丰度的方法，其特征在于：所述待测蛋白基因为外泌体相关基因。5.根据权利要求4所述的利用内参快速准确表征蛋白质相对丰度的方法，其特征在于：待测蛋白为外泌体腔内蛋白、膜上蛋白或膜外蛋白。6.根据权利要求1或2所述的利用内参快速准确表征蛋白质相对丰度的方法，其特征在于：待测蛋白相对丰度测定方法步骤如下：将含有第一报告基因、第二报告基因和待测蛋白基因的一个或两个质粒转入到靶细胞中；细胞培养后检测第一报告基因、第二报告基因信号；计算得到待测蛋白相对丰度。7.根据权利要求1或2所述的利用内参快速准确表征蛋...

【专利技术属性】
技术研发人员：葛啸虎，柴天聪，陆路，韩春乐，田应洲，王达，尹建新，王淼，张权，陈宁，
申请(专利权)人：天九再生医学天津科技有限公司，
类型：发明
国别省市：