产生亲合结合多特异性抗体的方法技术

本文报道了一种用于增加双特异性抗体的(亲合)结合特异性的方法，所述双特异性抗体包含与第一(细胞表面)抗原特异性结合的第一哺乳动物或哺乳动物源化结合位点和与第二(细胞表面)抗原特异性结合的第二结合位点，其中所述第一哺乳动物或哺乳动物源化结合位点是至少一对免疫球蛋白轻链可变结构域和免疫球蛋白重链可变结构域，通过如下所述降低所述哺乳动物或哺乳动物源化结合位点与其抗原的结合亲和力：通过将第一哺乳动物或哺乳动物源化结合位点中的位于所述轻链可变结构域的CDR中或所述重链可变结构域的CDR1或CDR2中或直接处于所述重链可变结构域中CDR3之前的两个框架位置中的位置处的至少一个氨基酸残基突变为存在于与所述哺乳动物或哺乳动物源化结合位点的物种相同的哺乳动物物种的种系免疫球蛋白氨基酸序列中的所述位置处的氨基酸残基。白氨基酸序列中的所述位置处的氨基酸残基。白氨基酸序列中的所述位置处的氨基酸残基。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】产生亲合结合多特异性抗体的方法


[0001]本专利技术属于抗体
，更具体地属于通过氨基酸序列修饰产生的多特异性抗体及其变体领域。本文报道了一种用于从单特异性亲和结合抗体开始产生具有亲合结合(avid binding)特性的多特异性抗体的方法。

技术介绍

[0002]两种单克隆抗体(mAb)的联合疗法已显示出有希望的结果，例如在实体瘤的治疗中。然而，两种mAb的施用需要单独的监管审查和批准。因此，下一代抗体疗法包括双特异性抗体(bsAb)，其特点是能够同时结合两个靶标(Tiller和Tessier 2015；Brinkmann和Kontermann 2017；Garber2014；Haurum 2006)。这些bsAb如何提高治疗活性有多种情况：一种情况是除了靶向治疗靶标之外，还能够靶向特定免疫细胞或蛋白质，从而分别增强效应子功能或抗体向特定器官的递送(van Spriel、van Ojik和van De Winkel 2000；Niewoehner等人2014；Fesnak等人2016)。通过双特异性提高抗体功效的其他方法是阻断两种不同的生物途径，或者通过双重靶向两种单个细胞表面抗原来简单地增加针对肿瘤细胞的特异性(Kontermann2012)。
[0003]如果抗原不仅展示在靶细胞上，而且也展示在非病原细胞上，则需要设计一种还靶向第二抗原的抗体，该第二抗原与仅在预期的治疗或作用位点发现的第一抗原组合。在这种情况下，尽管具有优先性，但双特异性本身并不一定会增加特异性。如果bsAb的单价亲和力对于结合而言是足够的，则仍然可以结合仅表达一种抗原的细胞。为了通过双特异性实现增加的特异性并避免脱靶效应，需要亲合结合。在这种情况下，单价结合亲和力不足以将抗体保留在细胞表面上，并且仅当至少两个结合位点可以与其特异性抗原结合时，bsAb才会被保留在细胞表面上。因此，此类结合物以高特异性但仍以非常低单价亲和力来识别靶标抗原。
[0004]当前产生低亲和力结合实体的方法包括，例如，从头产生抗体或引入突变以降低现有抗体的亲和力。以单价形式从头产生具有非常低(在理想情况下不可检测)亲和力的抗体被证明是困难的，并且与标准抗体产生技术不兼容，后者需要显著结合才能进行命中检测。为了规避这个问题但产生亲合结合实体，一种方法是采用现有的特异性结合物并将突变引入结合区域以降低亲和力。因此，确定了它们的结构，建立了抗原相互作用模型并引入了干扰突变。截至今天，丙氨酸扫描诱变是探索蛋白质
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蛋白质界面残基的首选方法(Mazor等人2017；Pons、Rajpal和Kirsch 1999)。这些方法的缺点是需要首先知道或确定抗体
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抗原复合物的晶体结构，在不了解结构的情况下引入突变可能会显著扰乱抗体结构，并且丙氨酸突变引入多反应性(Chuang等人2015)。带电氨基酸(包括精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸和组氨酸)的丙氨酸替换的模拟计算结果常常与实验室实验获得的值不一致(Kollman等人2000；Wang等人2001)。
[0005]WO 2018/093866报道了抗MET抗体、结合met的双特异性抗原结合分子及其使用方法。Mazor,Y.等人报道，通过调节双特异性抗体结合亲和力和形式效价增强了肿瘤靶向选
择性(Sci.Rep.7(2017)40098)。Ho,M.等人报道了体外抗体进化靶向种系热点以增加抗CD22免疫毒素的活性(J.Biol.Chem.280(2004)607
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617)。因此，需要一种通用的方法来产生在不存在多反应性的情况下亲和力降低的抗体衍生物。

技术实现思路

[0006]具有亲和力增强的特异性的双特异性抗体(bsAb)可用于以非常高的特异性寻址靶标细胞。此类亲合结合bsAb应仅与表达该bsAb的两种抗原的细胞有效结合，而不会与仅表达其中一种抗原的细胞结合。为了构建这样的bsAb，需要以高特异性识别两种抗原但具有各种(包括非常低的单价)亲和力的结合物组合。当两种抗原位于同一细胞上时，这尤其适用。
[0007]本专利技术至少部分地基于以下发现：具有高特异性的抗体可以转化为保留结合特异性但具有降低的单价结合亲和力的变体抗体。此类变体抗体，更准确地说是其结合位点，可以用作具有亲和力增强的特异性的亲合结合多特异性抗体中的结合位点。
[0008]本专利技术的一个方面是一种用于增加多特异性抗体的(亲合)结合特异性/亲合结合/降低结合亲和力的方法，
[0009]所述多特异性抗体包含与第一(细胞表面)抗原特异性结合的第一结合位点和与第二(细胞表面)抗原特异性结合的第二结合位点，其中还少所述第一结合位点是哺乳动物或哺乳动物源化结合位点，
[0010]其中第一结合位点是至少一对免疫球蛋白轻链可变结构域和免疫球蛋白重链可变结构域，
[0011](其中增加(亲合)结合特异性/亲合结合/降低结合亲和力是)通过如下所述降低第一结合位点与其抗原的结合亲和力进行：
[0012]通过将位于第一结合位点中的至少一个位置处的氨基酸残基突变为存在于与第一结合位点的物种相同的哺乳动物物种的种系免疫球蛋白氨基酸序列中所述位置的氨基酸残基，
[0013]从而增加双特异性抗体的(亲合)结合特异性/亲合结合，所述双特异性抗体包含与第一(细胞表面)抗原特异性结合的第一结合位点和与第二(细胞表面)抗原特异性结合的第二结合位点。
[0014]如本文所用，术语“亲合结合特异性/亲合结合”表示，基于单个(即一个)分子(抗体)的多个结合位点与其各自靶标(特异性抗原)的相互作用的组合强度，分子对一个或多个细胞的结合特异性/结合。
[0015]如本文所用，术语“种系免疫球蛋白氨基酸序列”表示由种系基因编码的氨基酸序列，其在体内充当在没有任何体细胞突变情况下的B细胞中抗体成熟过程中的起始序列(见图1)。
[0016]本专利技术的一个方面是一种用于增加多特异性抗体的总结合亲合力(avidity)的方法
[0017]所述多特异性抗体包含与第一(细胞表面)抗原特异性结合的第一结合位点和与第二(细胞表面)抗原特异性结合的第二结合位点，其中还少所述第一结合位点是哺乳动物或哺乳动物源化结合位点，
[0018]其中第一结合位点是至少一对免疫球蛋白轻链可变结构域和免疫球蛋白重链可变结构域，
[0019]通过降低第一个结合位点与其抗原的结合亲和力
[0020]通过将位于第一结合位点中的至少一个位置处的氨基酸残基突变为存在于与第一结合位点的物种相同的哺乳动物物种的种系免疫球蛋白氨基酸序列中所述位置的氨基酸残基，
[0021]从而增加双特异性抗体的总结合亲合力，所述双特异性抗体包含与第一(细胞表面)抗原特异性结合的第一结合位点和与第二(细胞表面)抗原特异性结合的第二结合位点。
[0022]在所有方面的一个实施例中，多特异性抗体至少是双特异性抗体。在一个优选实施例中，多特异性抗体是双特异性抗体。
[0023]在所有方面的一个实本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于降低双特异性抗体的结合亲和力的方法，所述双特异性抗体包含与第一细胞表面抗原特异性结合的第一结合位点和与第二细胞表面抗原特异性结合的第二结合位点，其中所述第一抗原和所述第二抗原位于同一细胞上，其中所述第一结合位点是哺乳动物或哺乳动物源化结合位点，其中所述第一结合位点是至少一对免疫球蛋白轻链可变结构域和免疫球蛋白重链可变结构域，其中所述降低结合亲和力是通过以下所述来降低所述第一结合位点与其抗原的结合亲和力：将所述第一结合位点中的位于所述轻链可变结构域的CDR中或所述重链可变结构域的CDR1或CDR2中或直接处于所述重链可变结构域中CDR3之前的两个框架位置中的位置处的至少一个氨基酸残基突变为存在于与所述哺乳动物或哺乳动物源化结合位点的物种相同的哺乳动物物种的种系免疫球蛋白氨基酸序列中的所述位置处的氨基酸残基。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述种系免疫球蛋白氨基酸序列是在所述哺乳动物物种的所有种系免疫球蛋白氨基酸序列的序列比对中具有最高同一性的所述种系免疫球蛋白氨基酸序列。3.根据权利要求1或2中任一项所述的方法，其中为了在所述重链可变结构域的情况下确定所述种系免疫球蛋白氨基酸序列...

【专利技术属性】
技术研发人员：U，
申请(专利权)人：豪夫迈，
类型：发明
国别省市：