一种用于检测人体液中乙酰胆碱受体自身抗体的细胞爬片及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种用于检测人体液中乙酰胆碱受体自身抗体的细胞爬片及其制备方法和应用，属于生物技术领域。采用的方案包括：将乙酰胆碱受体的各个亚基与空载质粒按照一定的比例进行共同转染，再经过固定、洗涤、终止、洗涤、烘干处理，制得检测人体液中乙酰胆碱受体自身抗体的细胞爬片。该方法与放免法和酶联免疫法相比，具有较高的灵敏度；与现有技术的文献所报道的免疫荧光方法相比，在降低了背景的同时提高了检测的特异性。因此，无论从研究角度还是作为重症肌无力疾病的辅助诊断手段，本发明专利技术均具有良好的应用前景。发明专利技术均具有良好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测人体液中乙酰胆碱受体自身抗体的细胞爬片及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于生物
，涉及一种用于检测乙酰胆碱受体自身抗体的细胞爬片及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]重症肌无力(myasthenia gravis，MG)是乙酰胆碱受体抗体(AchR
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Ab)介导的神经
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肌肉接头(NMJ)处传递障碍的自身免疫性疾病，病变主要累及NMJ突触后膜上乙酰胆碱受体(acetyl cholinergic receptor，AchR)。目前，检测重症肌无力自身抗体的方法主要有放免法，酶联免疫法等。现已有证据表明，有部分重症肌无力症状的患者样本通过放免法检测的结果为阴性，酶联免疫吸附法与放免法存在同样的问题。以细胞为底物的免疫荧光法(CBA，Cell Based Assay)克服了上述两种方法的缺点，通过在细胞表面表达出完整且有正确构像的AchR抗原，可检出放免法或酶联免疫法检测后阴性或低滴度重症肌无力患者，提高了重症肌无力患者血清的阳性检出率。因此，AchR免疫荧光方法的广泛应用可以为疾病的早期诊断及后续治疗提供有效的帮助。
[0003]Rapsyn是突触后膜乙酰胆碱受体缔合蛋白，由肌肉细胞表达，被认为是一种“生物锚定蛋白”，Rapsyn通过与乙酰胆碱受体互作，以催化它们的聚集，从而确保神经递质的传递(M K,Ramarao.J B,Cohen.Mechanism of nicotinic acetylcholine receptor cluster formation by rapsyn.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1998,95:4007
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4012)。现有AchR自身抗体的CBA法，均是通过将Rapsyn与AchR的α、β、δ、ε和/或γ亚基按照一定比例进行瞬时或稳定转染，通过Rapsyn聚集作用，将AchR的各亚基表达于HEK293细胞表面，然后对过表达的细胞进行固定后检测患有重症肌无力症状的样本(Guang Zhao,Xiaoqing Wang,Xiaowen Yu,et al.Clinical application of clustered AchR for the detection of SNMG.Scientific Reports.2015,5:10193.欧蒙医学实验诊断股份公司申请专利：用于检测针对乙酰胆碱受体的自身抗体的方法.管阳太申请专利：一种乙酰胆碱受体簇集稳定表达的细胞模型及应用方法)。但是，Rapsyn作为一种自身抗原，将其与AchR各亚基进行瞬时转染获得过表达AchR的抗原细胞均会有Rapsyn抗原的表达，从而在进行样本检测时，有可能无法区分Rapsyn与AchR抗体阳性(Agius MA,Zhu S,Kirvan CA,etal.Rapsyn antibodies in myasthenia gravis.Ann N Y Acad Sci.1998,841:516
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21)。有数据表明，在重症肌无力患者的血清中，Rapsyn自身抗体的阳性率高达15％。但是，目前却没有证据表明rapsyn抗体阳性和重症肌无力的严重程度或某一类亚型有关，与此同时，在一些其他类型的自身免疫性疾病，如系统性红斑狼疮中检测到了rapsyn抗体。因此，有必要提供一种仅含有过表达AchR各亚基(αβδε和/或γ亚基)的细胞爬片，在现有技术的基础上，增加AchR自身抗体检测的特异性。
[0004]1995年，A.Vincent等人研究发现，含有P3A+的α亚基不能与MIR mAbs和α
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BuTX结合，从而认为含有P3A+的α亚基不能组装成有功能的AchR(C.F.Newland,D.Beeson,
A.Vincent et al.Functional and non
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functional isoforms of the human muscle acetylcholine receptor.Journal of Physiology.1995,489:767
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778)。2002年，Shigeaki Suzuki等研究团队使用重组P3A+的α亚基刺激来自于MG患者和健康人血清中的T细胞，结果表明存在特异识别P3A+序列的T细胞，并且这些T细胞可在患有胸腺瘤和继发性疾病的重症肌无力患者血清中检测到(Shigeaki Suzukia,Kortaro Tanaka,Hidekata Yasuoka,et al.Autoreactive T cells to the P3A+isoform of AchR a subunit in myasthenia gravis.Journal of Neuroimmunology.2002,137:177
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186)。因此，基于不同方法得到的关于AchRα亚基P3A+是否有功能的结论存在着不一致的情况。
[0005]因此，现有技术的缺陷和不足总结如下：
[0006]1、现有的研究结果对于AchRα亚基P3A序列在检测阳性样本中是否有必要无明确的定论；
[0007]2、Rapsyn是一种自身抗原，它作为辅助蛋白促进AchR各亚基的正确折叠，将其与AchR各亚基进行瞬时转染获得过表达AchR的抗原细胞均会有Rapsyn抗原的表达，在进行样本检测时，有可能无法区分Rapsyn与AchR抗体阳性，从而会有假阳性结果出现；
[0008]3、免疫荧光法作为一种可供使用的辅助检测手段，目前尚无商品化的免疫荧光法检测试剂盒。

技术实现思路

[0009]为了克服上述现有技术的缺点，本专利技术的目的在于提供一种用于检测人体液中乙酰胆碱受体自身抗体的细胞爬片及其制备方法和应用。
[0010]为了达到上述目的，本专利技术采用以下技术方案予以实现：
[0011]本专利技术公开的一种用于检测乙酰胆碱受体自身抗体的细胞爬片的制备方法，包括：将乙酰胆碱受体的各个亚基的重组真核表达载体与一个无外源基因连入的真核表达载体按照一定的比例混合，进行共同转染，再经过固定、洗涤、终止、洗涤、烘干处理，制得检测乙酰胆碱受体自身抗体的细胞爬片。
[0012]进一步地，使用时，待检测的样本为包含抗体的体液，所述体液优选地选自全血、血清、脑脊液和唾液。
[0013]优选地，所述将乙酰胆碱受体的各个亚基的重组真核表达载体与一个无外源基因连入的真核表达载体混合，按照一定的比例进行共转，具体操作为：
[0014]将乙酰胆碱受体的各个亚基基因α1(P3A
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)、β1、δ1、ε和γ通过分子克隆方法分别连至一个空载质粒，分别构建得到各个亚基基因α1(P3A
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)、β1、δ1、ε和γ的重组载体；
[0015]再将上述各个亚基基因α1(P3A
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)、β1、δ1、ε和γ的重组载体与一个无外源基因连入的真核表达载体混合，获得共转质粒，将该共本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测人体液中乙酰胆碱受体自身抗体的细胞爬片的制备方法，其特征在于，包括：将乙酰胆碱受体的各个亚基的重组真核表达载体与一个无外源基因连入的真核表达载体按照一定的比例混合，进行共同转染，再经过固定、洗涤、终止、洗涤、烘干处理，制得检测乙酰胆碱受体自身抗体的细胞爬片。2.根据权利要求1所述的用于检测乙酰胆碱受体自身抗体的细胞爬片的制备方法，其特征在于，所述将乙酰胆碱受体的各个亚基的重组真核表达载体与一个无外源基因连入的真核表达载体混合，按照一定的比例进行共转，具体操作为：将乙酰胆碱受体的各个亚基基因α1(P3A
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)、β1、δ1、ε和γ通过分子克隆方法分别连至一个空载质粒，分别构建得到各个亚基基因α1(P3A
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)、β1、δ1、ε和γ的重组载体；再将上述各个亚基基因α1(P3A
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)、β1、δ1、ε和γ的重组载体与一个无外源基因连入的真核表达载体混合，获得共转质粒，将该共转质粒转染至已经铺好细胞的爬片上。3.根据权利要求2所述的用于检测乙酰胆碱受体自身抗体的细胞爬片的制备方法，其特征在于，各个亚基基因α1(P3A
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)、β1、δ1、ε和γ的重组载体与一个无外源基因连入的真核表达载...

【专利技术属性】
技术研发人员：闫亚平，赵子越，郝文斌，封雪，李科，
申请(专利权)人：陕西脉元生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：