干血片中25-羟基维生素D的液相色谱串联质谱检测方法及试剂盒技术

本发明专利技术提供干血片中25

【技术实现步骤摘要】
干血片中25
‑
羟基维生素D的液相色谱串联质谱检测方法及试剂盒


[0001]本专利技术属于干血片中25
‑
羟基维生素D检测
，具体是涉及到干血片中25
‑
羟基维生素D的液相色谱串联质谱检测方法及试剂盒。

技术介绍

[0002]维生素D是人体内一种重要的调节因子，除参与人体内钙磷代谢，其还与心血管疾病、高血压、免疫疾病、肿瘤及糖尿病等疾病密切相关。25
‑
羟基维生素D是衡量维生素D营养状态的最佳指标，是维生素D在人体内的主要存在形式，其性质稳定，能充分反应食物摄入与自身合成的维生素D总量。当前已有多种商业化及实验室自行开发的方法用于25
‑
羟基维生素D的常规检测，包括蛋白结合法、放射免疫法、自动化学发光法、ELISA法及LC
‑
MS/MS法。虽然蛋白结合法简便快速，但是LC
‑
MS/MS法具有高灵敏度和高选择性的特点被视为作为维生素D测定的金标准。
[0003]另外，免疫法和蛋白结合法只能检测总25
‑
羟基维生素D，而LC
‑
MS/MS法可以分别检测25
‑
羟基维生素D2和25
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羟基维生素D3。免疫法另外一个特点是灵敏度低，这使得测定结果不够准确。然而，由于25
‑
羟基维生素D属于脂溶性化合物，缺乏易电离的基团，使LC
‑
MS/MS法检测变得非常困难，本专利技术对25/>‑
羟基维生素D检测方法进行改良，通过对样本中的25
‑
羟基维生素D衍生化，并在LC
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MS/MS流动相中加入离子化试剂，提高了目标物的离子对程度，从而大大提高了灵敏度，适用于样本中更微量25
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羟基维生素D的检测。

技术实现思路

[0004]针对上述现有技术的不足，本专利技术提供了干血片中25
‑
羟基维生素D的液相色谱串联质谱检测方法及试剂盒，通过对目标物质进行衍生化，同时在色谱条件上选择了提高离子化效率的添加剂，使得25
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羟基维生素D的检测灵敏度提高了近400倍，从而解决了当前的检测方法普通存在检测下限达不到要求、检测结果不稳定的问题，并且由于本专利技术适用于干血片样本，间接解决了血液样本的储存和运输条件要求苛刻的问题。
[0005]本专利技术通过以下技术方案得以实现：
[0006]干血片中25
‑
羟基维生素D的液相色谱串联质谱检测方法，包括以下步骤：
[0007]步骤1、样本前处理：
[0008]提取：用打孔器取1
‑
2个血斑样本到离心管中，加入内标溶液10μL，稳定30
‑
300s，加入100
‑
500μL提取剂超声提取15min；
[0009]沉淀：在提取完毕的溶液中加入200
‑
1000μL沉淀剂，超声15min；
[0010]萃取：将0.6
‑
2mL萃取剂加入到沉淀完毕的溶液中，涡旋5
‑
20min后，5000
‑
15000rpm的转速离心5min，取上层萃取液至玻璃管中，35
‑
60℃氮气吹干；
[0011]衍生化：将10
‑
80μL衍生化试剂加入到吹干后的残渣中，恒温水浴下反应0.5
‑
1.2h后加入10
‑
50μL反应终止剂，涡旋混匀，取得到的溶液转移至内插管中，进样分析；
[0012]步骤2、液相色谱串联质谱检测
[0013]检测方法为液相色谱串联质谱法，其中质谱采用的是多反应监测MRM扫描方式，所述液相色谱条件如下：
[0014]流动相A为含有0
‑
100mmol/L的甲酸、甲酸铵、甲胺、二甲胺、乙胺中任一种或任意多种的水溶液，流动相B为0
‑
100mmol/L的甲酸、甲酸铵、甲胺、二甲胺、乙胺中任一种或任意多种的甲醇溶液，柱温30
‑
45℃，检测时间为2
‑
8min，进样量为5
‑
20μL，采用梯度洗脱方式，洗脱参数见表1；
[0015]表1为梯度洗脱参数
[0016]时间(min)流速(μL/min)流动相A(％)流动相B(％)0.160030700.660001001.860001001.81600307036003070
[0017]其中：25
‑
羟基维生素D2衍生物的保留时间为1.71min；25
‑
羟基维生素D3衍生物的保留时间为1.69min；
[0018]所述多反应监测MRM质谱的参数见表2；
[0019]表2为质谱参数
[0020][0021]优选地，所述步骤1中干血片的制备方法为：将50μL新鲜血液滴到12mm滤纸片中心上，使血滴分部均匀，滤纸片晾干后密封保存备用。
[0022]优选地，所述步骤1中血斑样本的直径为12mm。
[0023]优选地，所述步骤1中内标液浓度25
‑
羟基维生素D2内标和25
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羟基维生素D3内标浓度均为50ng/mL，溶剂为甲醇。
[0024]优选地，所述步骤1中提取剂为纯水。
[0025]优选地，所述步骤1中沉淀剂为甲醇。
[0026]优选地，所述步骤1中萃取剂为正己烷。
[0027]优选地，所述步骤1中衍生化试剂的配制方法如下：用乙腈配制浓度为2mg/mL的4
‑
苯基
‑
1,2,4
‑
三唑林
‑
3,5
‑
二酮的衍生化储备液，再用乙腈进一步稀释得到浓度为0.2mg/mL的衍生化试剂。
[0028]优选地，所述步骤1中恒温为25℃。
[0029]优选地，所述步骤1中终止剂为乙醇。
[0030]优选地，所述步骤2中流动相A、B中均含有50mmol/L甲胺。
[0031]优选地，所述步骤2中质谱条件还包括正离子模式下，采用ESI离子源，用于检测的离子对m/z分别是：25
‑
(OH)D2衍生化产物619.4
→
298.2、25
‑
(OH)D3衍生化产物607.5
→
298.2、25
‑
(OH)D2内标622.3
→
301.3、25
‑
(OH)D3内标610.3
→
301.3；气帘气(CUR)为20，碰撞气(CAD)为6，温度为600℃，电压为5500，离子源气流(GS1)为50，(GS2)为50。
[0032]在本专利技术中，通过衍生反应能够增加25
‑...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.干血片中25
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羟基维生素D的液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1、样本前处理提取：用打孔器取1
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2个血斑样本到离心管中，加入内标溶液10μL，稳定30
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300s，加入100
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500μL提取剂超声提取15min，用于使目标物从干血斑中充分溶解出来；沉淀：在提取完毕的溶液中加入200
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1000μL沉淀剂，超声15min；萃取：将0.6
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2mL萃取剂加入到沉淀完毕的溶液中，涡旋5
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20min后，5000
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15000rpm的转速离心5min，取上层萃取液至玻璃管中，于35
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60℃下用氮气吹干；衍生化：将10
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80μL衍生化试剂加入到吹干后的玻璃管中，25
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40℃恒温水浴下反应0.5
‑
1.2h后，加入10
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50μL反应终止剂，涡旋混匀，取得到的溶液转移至内插管中，进样分析；步骤2、液相色谱串联质谱检测检测方法为液相色谱串联质谱法，其中质谱采用的是多反应监测MRM扫描方式，所述液相色谱条件如下：流动相A为含有0
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100mmol/L的甲胺的水溶液，流动相B为0
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100mmol/L的甲胺的甲醇溶液，柱温30
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45℃，检测时间为2
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8min，进样量为5
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20μL，采用梯度洗脱方式，洗脱参数见表1；表1为梯度洗脱参数时间(min)流速(μL/min)流动相A(％)流动相B(％)0.160030700.660001001.860001001.81600307036003070其中：25
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羟基维生素D2衍生物的保留时间为1.71min；25
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羟基维生素D3衍生物的保留时间为1.69min；所述多反应监测MRM质谱的参数见表2。表2为质谱参数表2为质谱参数2.根据权利要求1所述的干血片中25
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羟基维生素D的液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，所述步骤1中提取剂为纯水。3.根据权利要求1所述的干血片中25
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羟基维生素D的液相色谱串联质谱检测方法，其
特征在于，所述步骤1中沉淀剂为甲醇。4.根据权利要求1所述的干血片中25
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羟基维生素D的液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，所述步骤1中萃取剂为正己烷。5.根据权利要求1所述的干血片中25
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羟基维生素D的液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，所述步骤1中衍生化试剂的配制方法如下：用乙腈配制浓度为2mg/mL的4
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苯基
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1,2,4
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三唑林
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3,5
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【专利技术属性】
技术研发人员：曾彦雯，刘传兴，林克萌，
申请(专利权)人：青岛惠安康生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：