一种测定生物样品中雷公藤甲素药物浓度的HPLC-MS/MS方法技术

本发明专利技术涉及生物检测分析领域，具体是一种测定生物样品中雷公藤甲素药物浓度的HPLC

【技术实现步骤摘要】
一种测定生物样品中雷公藤甲素药物浓度的HPLC
‑
MS/MS方法


[0001]本专利技术涉及生物检测分析
，具体地说，是一种检测生物样品中雷公藤甲素药物浓度的HPLC
‑
MS/MS(高效液相色谱联合质谱法)方法。

技术介绍

[0002]雷公藤甲素是中药雷公藤的主要活性成分，具有免疫抑制、抗生育、抗炎以及广谱的抗肿瘤活性，对某些特殊瘤株的抑制效果甚至强于现有的一线抗肿瘤药如阿霉素、丝裂霉素、顺铂等。雷公藤甲素在国内主要用于治疗自身免疫性疾病和炎症，包括类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮和皮肤病，表现出非常好的疗效。尽管雷公藤甲素具有多种生物活性，但也被认为是雷公藤毒性的主要来源。雷公藤甲素主要从肝和肾排泄，往往伴随着血液毒性和肝肾毒性及骨髓抑制。药物疗效、毒性均与血药浓度和组织浓度相关。为了保证达到有效的治疗浓度和避免不良反应，需要准确、灵敏的定量分析方法以测定雷公藤甲素在血浆和组织中的药物浓度。
[0003]现有技术中雷公藤甲素的定量方法主要有高效液相色谱法、紫外分光光度法，但雷公藤甲素在这些方法检测中响应值低、灵敏度低、特异性差，导致测定结果不准确。因此，需要建立一种可以准确高效测定雷公藤甲素浓度的检测方法。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于针对上述不足，设计一种测定生物样品中雷公藤甲素药物浓度的HPLC
‑
MS/MS方法：以卡马西平为内标，用乙酸乙酯对血浆和各组织中的药物进行萃取，再使用高效液相色谱分离上清液中的药物成分，然后使用高分辨质谱多反应监测模式进行药物定性检测，并进行定量，实现对血浆和各组织样本中雷公藤甲素浓度进行分析测定。
[0005]本专利技术提供一种检测生物样品中雷公藤甲素药物浓度的方法，所述的方法为高效液相色谱联合质谱法(HPLC
‑
MS/MS)，所述的生物样品为血浆和心肝脾肺肾组织，包括以下步骤：
[0006](A)储备液的制备：以甲醇为溶剂，配制得到雷公藤甲素标准品储备液和内标卡马西平储备液；
[0007](B)标准曲线血浆样本和标准曲线组织样本的制备：取空白血浆和空白心肝脾肺肾组织匀浆液，加入步骤(A)制备的雷公藤甲素标准品储备液和内标卡马西平储备液，得到标准曲线血浆样本和标准曲线组织样本；
[0008](C)标准曲线的设计：取步骤(B)得到的标准曲线血浆样本和标准曲线组织样本置于离心管中，加入乙酸乙酯萃取，涡旋离心后，取上清，用真空离心浓缩仪挥干，甲醇复溶，再次涡旋离心，取上清液在高效液相色谱质谱联用仪上进样分析，记录色谱图，计算雷公藤甲素峰面积和内标峰面积的比值，以药物浓度为横坐标，以药物峰面积和内标峰面积比值为纵坐标，用加权最小二乘法进行回归运算，求得回归方程即为血浆标准曲线和各组织标准曲线；
[0009](D)待测血浆样本和待测组织样本的制备：取待测血浆或组织匀浆液，加入乙酸乙酯萃取，涡旋离心后，取上清，用真空离心浓缩仪挥干，甲醇复溶，再次涡旋离心，取上清，即得到待测血浆样本或待测组织样本；所述的组织匀浆液的制备方法是取心、肝、脾、肺、肾组织，称重，按重量加入2倍体积的生理盐水，研磨，得组织匀浆液；
[0010](E)待测血浆样本和待测组织样本中雷公藤甲素药物浓度的计算：取步骤(D)制备的待测血浆样本和待测组织样本在高效液相色谱质谱联用仪上进样分析，记录色谱图，计算药物峰面积和内标峰面积的比值；根据步骤(C)得到的标准曲线计算待测血浆样本和待测组织样本中雷公藤甲素浓度。
[0011]在本专利技术的一个具体的实施方式中，所述的标准曲线血浆和标准曲线各组织样本中雷公藤甲素浓度范围为：血浆20
‑
1000ng/mL；心50
‑
1000ng/mL；肝20
‑
1000ng/mL；脾20
‑
1000ng/mL；肺20
‑
500ng/mL；肾20
‑
1000ng/mL；标准曲线血浆样本和标准曲线组织样本中内标卡马西平浓度均为l ng/mL。
[0012]在本专利技术的一个优选的实施方式中，所述的液相色谱关键参数：WATERS ACQUITY UPLC BEH C
18
色谱柱：2.1mm
×
100mm，1.7μm；ACQUITY UPLC BEH C
18 VanGuard Pre
‑
column保护柱：2.1mm
×
5mm，1.7μm；流动相为流动相A和流动相B。流动相梯度洗脱条件：0～4min，流动相A的体积分数为60％，流动相B的体积分数为40％；其中，流动相A为体积分数为100％甲醇，流动相B为体积分数为0.1％的甲酸水溶液，流速为0.3mL/min，进样量10μL，柱温40℃，等度洗脱，时间为4min。经过液相色谱条件优化，以上参数为适用于本方法的最优分离条件。在此条件下，目标物、内标及其他基质可以实现良好的分离，峰型良好，互不干扰。
[0013]在本专利技术的一个优选的实施方式中，所述的质谱条件和关键参数：电喷雾离子源ESI，正离子检测，多反应监测MRM工作方式；喷雾器电压：5500V；离子源温度：600℃；雾化温度：420℃；雾化器压力：40psi；碰撞气压：7psi；干燥气温度：350℃，干燥气流速：8L/min；鞘气温度：350℃，鞘气流速：11L/min，鞘气压力：23psi；毛细管电压：4000V；雷公藤甲素裂解电压：145V，碰撞能量：33eV；内标卡马西平裂解电压：115V，碰撞能量：15eV；雷公藤甲素母离子/特征子离子的定量离子对：361
→
105；卡马西平母离子/特征子离子的定量离子对为237
→
194；各离子对的驻留时间均为50ms。经过质谱条件优化，以上参数为适用于本专利技术的最优质谱检测条件。在此条件下，目标物和内标的特异性最强，灵敏度和响应值最高，基线平稳，相比于现有的方法显著提高了检测效率和准确性；而采用该参数之外的数值，会降低目标物和内标的特异性和响应值。
[0014]进一步的，步骤C和步骤D所述的离心条件为：4℃、12000rpm、10min。
[0015]进一步的，步骤C和步骤D所述的浓缩挥干条件为：40℃、1h、200rpm。
[0016]更进一步的，所述的方法还包括液质方法学评价，具体包括：专属性、线性、精密度、准确度、方法回收率、基质效应和稳定性。
[0017]在本专利技术的一个优选的实施方式中，所述的标准曲线血浆样本和标准曲线组织样本由以下方法制得：取100μL空白血浆，分别加入100μL一系列甲醇稀释后的不同浓度的药物储备液和100μL内标储备液，制得不同标准浓度的标准曲线血浆样本。取200μL各组织匀浆液，分别加入100μL一系列甲醇稀释后的不同浓度的雷公藤甲素储备液和100μL内标储备液，制得不同浓度的标准曲线组织样本。其中，所述的药物储备液是以甲醇为溶剂配制的浓度为本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测生物样品中雷公藤甲素药物浓度的方法，其特征在于，所述的方法为高效液相色谱联合质谱法，所述的生物样品为血浆和心肝脾肺肾组织，包括以下步骤：(A)储备液的制备：以甲醇为溶剂，配制得到雷公藤甲素标准品储备液和内标卡马西平储备液；(B)标准曲线血浆样本和标准曲线组织样本的制备：取空白血浆和空白心肝脾肺肾组织匀浆液，加入步骤(A)制备的雷公藤甲素标准品储备液和内标卡马西平储备液，得到标准曲线血浆样本和标准曲线组织样本；(C)标准曲线的设计：取步骤(B)得到的标准曲线血浆样本和标准曲线组织样本置于离心管中，加入乙酸乙酯萃取，涡旋离心后，取上清，用真空离心浓缩仪挥干，甲醇复溶，再次涡旋离心，取上清液在高效液相色谱质谱联用仪上进样分析，记录色谱图，计算雷公藤甲素峰面积和内标峰面积的比值，以药物浓度为横坐标，以药物峰面积和内标峰面积比值为纵坐标，用加权最小二乘法进行回归运算，求得回归方程即为血浆标准曲线和各组织标准曲线；(D)待测血浆样本和待测组织样本的制备：取待测血浆或组织匀浆液，加入乙酸乙酯萃取，涡旋离心后，取上清，用真空离心浓缩仪挥干，甲醇复溶，再次涡旋离心，取上清，即得到待测血浆样本或待测组织样本；(E)待测血浆样本和待测组织样本中雷公藤甲素药物浓度的计算：取步骤(D)制备的待测血浆样本和待测组织样本在高效液相色谱质谱联用仪上进样分析，记录色谱图，计算药物峰面积和内标峰面积的比值；根据步骤(C)得到的标准曲线计算待测血浆样本和待测组织样本中雷公藤甲素浓度。2.根据权利要求1所述的检测生物样品中雷公藤甲素药物浓度的方法，其特征在于，所述的标准曲线血浆和标准曲线各组织样本中雷公藤甲素浓度范围为：血浆20
‑
1000ng/mL；心50
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1000ng/mL；肝20
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1000ng/mL；脾20
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1000ng/mL；肺20
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500ng/mL；肾20
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1000ng/mL；标准曲线血浆样本和标准曲线各组织样本中内标卡马西平浓度均为l ng/mL。3.根据权利要求1所述的检测生物样品中雷公藤甲素药物浓度的方法，其特征在于，所述的液相色谱条件和参数：WATERS ACQUITY UPLC BEH C
18
色...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘继勇，姜良弟，赵语南，李爱雪，顾永卫，杜月，李丹，
申请(专利权)人：复旦大学附属肿瘤医院，
类型：发明
国别省市：