基因编码化合物库起始头片段化合物及其在基因编码化合物库合成上的应用制造技术

本发明专利技术提供了基因编码化合物库起始头片段化合物及其在基因编码化合物库合成上的应用，普适性好、条件较温和、操作方便、收率高，适用于多孔板进行的基因编码化合物库的合成，增加了基因编码化合物库中寡聚核酸与含有游离氨基类小分子化合物反应的底物类型，扩大了基因编码化合物库的多样性。因编码化合物库的多样性。因编码化合物库的多样性。

【技术实现步骤摘要】
基因编码化合物库起始头片段化合物及其在基因编码化合物库合成上的应用


[0001]本专利技术属于生物化学领域，具体涉及基因编码化合物库起始头片段化合物及其在基因编码化合物库合成上的应用。

技术介绍

[0002]任何一种药物的开发都是一个漫长且耗资巨大的过程。据药物研发的统计资料报道，一种新药从开始研发到最终批准投放市场，平均需10年的时间，研究费用更是高达～26亿美元。药物的研制历程之所以这样漫长，费用高昂，其中很重要的一个原因是先导化合物的发现与优化过程缓慢
[1]。基于化学结构的药物设计(Structure
‑
based drug design，简称 SBDD)：根据目标蛋白质的3D结构特征，依赖于计算机算法指导小分子化合物结构设计与筛选，是发现先导化合物的一个重要途经
[2]。基于有机化合物分子片段的筛选方法(Fragment screen)以及其筛选出先导化合物的方法(Fragment based lead generation，简称FBLG)：通常对几千个小分子量(<200Da)的化合物组，在高浓度下进行筛选。这些基于小分子片段进行的筛选方法是早期发现活性化合物的有效途经
[3]。在新型药物的研发过程中，科学家们不断地寻求更多有效的筛选方法，以便在许多化合物中通过对生物学靶标的结合亲和力和/或药理学效力以无差异性的筛选方式找到优异的活性化合物。高度自动化以及深度优化后的多种高通量筛选法在活性化合物的筛选与发现中的重要作用是无可争议的。经过许多年的应用、发展与完善，高通量筛选已经建立起了高度自动化、完善的筛选流程、以及与之相伴的提升的化学分子库质量和增长的化合物数量，是国际上主流的药物研发公司获得目标蛋白的先导化合物的重要途经。但是，高成本导致了化学结构及化合物总数上的局限性，以至于传统的药物研发方法越来越不能满足新药研发的需求。在很多疾病蛋白的筛选实践中用这种传统方法是徒劳无功的。为了能突破高通量筛选方法的瓶颈，使筛选的化合物在化学结构空间及数量上能呈现几何级数上的飞跃，及使用一种全新的生物筛选模式，基因编码库技术(DELT)应运而生。DELT正在改变药物发现研究领域里的游戏规则。Brenner和Lerner于1992年提出 DELT的原创理论并预见了它能够使用比传统方法更快捷的方式来合成和筛选数量庞大的基因编码化合物库
[4]。
[0003]与传统高通量筛选相比，基因编码化合物库极大地增加了化合物的数量和多样性
[5]。在很小的体积例如几十微升的反应管中，通过一系列反应，可以合成上千万甚至上亿种不同的化合物
[6]。DELT的原理是用不同特定序列的基因片段来标记反应过程中的每一个小分子化合物，用组合化学的策略，通过使用拆分、合并(split and pool)的方法，利用有限的成本和时间，大量合成百万级至百亿级连接有特定基因序列的化合物文库
[7]。然后将所得化合物的混合物与蛋白质靶标一起孵育，通过洗去没有与蛋白质靶标结合的化合物而达到物理分离并找到具有高结合亲和力的化合物
[8]。孵育靶标蛋白质所需的基因编码化合物库只需极其小的剂量规模(微克) 而且可以在很短时间内(比如1天内)进行。可以轻松地在不同条件下
[9] (例如，溶液的酸碱度、样品蛋白混合方式、蛋白质浓度、存在或不存在竞
争化合物、存在不同的缓冲液或辅助因子)进行多项筛选实验。由于基因序列与化合物结构一一对应，通过聚合酶链式反应(Polymerase ChainReaction，简称PCR)扩增和下一代测序(Next Generation Sequencing，简称NGS)读取后，就可以通过基因序列解码得到活性化合物的化学结构式。然后对具有高结合亲和力化合物进行“脱离基因”的单独合成，并测定没有附着基因的化合物与目标蛋白质的结合力以确认其生物活性。
[0004]先导化合物的发现是新药研发的重要步骤，高起点的先导化合物是新药研发成功的关键因素之一。基因编码化合物库是诸多先导化合物筛选方法中引人注目的方法之一
[10]。它以传统方法无可比拟的化合物数量、化学结构多样性以及对生物目标蛋白独特的结合方式脱颖而出。最近二十年来在新药研发领域取得的进展已将DELT转变为大多数制药公司新药研发产品的强大工具
[11
‑
12]。它不仅能为传统的生物学靶标蛋白寻找新的配体，而且能为困扰药物学家的新颖靶标蛋白以及用传统方法无法找到亲和物的疾病蛋白筛选到配体。因此，DELT将有助于找到药物化学研究的重要起点
‑
先导化合物。尽管如此，DELT面对的挑战仍然是如何拓展文库小分子的化学空间以及优化其物理化学性质
[13
‑
15]和卓越的生物筛选方法。
[0005]最近几年在这一领域里出现的在活细胞上的生物筛选方法，是一个引人注目的成就
[16]。在活细胞上的筛选将不再需要纯化过的靶标蛋白，也无需对蛋白进行修饰，更好地保持了蛋白的原生态结构，而且可以直接找到有细胞活性的先导化合物。这样，药物学家能够在此平台上找到更好的先导化合物
[17
‑
18]。
[0006]在基因编码化合物库的合成中，将基因片段末端与目标化合物库相连是最开始也是关键的步骤之一。目前最常用的方法是通过基因末端的氨基与小分子羧酸缩合形成酰胺键来链接，此方法适用性较好，但不适用于与含有游离氨基类小分子化合物的链接
[19]。
[0007][0008]上式是DELT文献中常用的链接方式。
[0009][0010]通过基因末端羧基与含有游离氨基类小分子化合物进行反向缩合形成酰胺键的方法也有报道(如上式所示)。但是这种方法普适性不好，因其能够导致在接下来的酰胺反应中发生分子内环化副反应、并使得产物稳定性不好。这种链接方式导致反应收率普遍偏低，因此只有有限的应用
[20]。
[0011][0012]上式展示了本专利技术中提出的基因编码化合物库起始头片段化合物与含有游离氨
基类小分子化合物的链接方式。
[0013]为解决以上问题，得到一种普适性较好的能够使基因末端与含有游离氨基类小分子化合物结合的合成新方法，我们研究并开发了基因编码化合物库起始头片段化合物及其在基因编码化合物库合成上与含有游离氨基类小分子化合物合成的应用。该基因编码化合物库起始头片段化合物相比于传统的羧酸起始头片段有着明显的优势
[19]：1)新颖的链接方式而引导出新的产物的化学空间；2)增加了底物分子的多样性；3)化学文库的分子量更小；4)更高的化学文库稳定性。

技术实现思路

[0014]本专利技术所要解决的技术问题在于，提供基因编码化合物库起始头片段化合物及其在基因编码化合物库合成上的应用。其特征在于，基因编码化合物库起始头片段化合物与寡聚核酸链接得到寡聚核酸链接化合物，然后在硼酸钠无机盐缓冲液存在下与含有游离氨基类小分子化合物反应得到基因编码化合物。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.基因编码化合物库起始头片段化合物，其结构通式如下：其特征在于，所述的结构通式中，Y包括羧酸类、2,5
‑
二氧杂吡咯烷
‑1‑
基羧酸酯类，X包括对甲苯磺酰基(OTs)、溴，n＝3、4；m＝1、2、3、4；优选地，Y为2,5
‑
二氧杂吡咯烷
‑1‑
基羧酸酯类，X是对甲苯磺酰基(OTs)，n＝3；m＝1。2.基因编码化合物库起始头片段化合物与寡聚核酸链接化合物，结构通式如下：其特征在于，所述的结构通式中，X包括对甲苯磺酰基(OTs)、溴，n＝3、4，m＝1、2、3、4；优选地，X是对甲苯磺酰基(OTs)，n＝3，m＝1。其中，寡聚核酸是由经人工修饰的和/或未修饰的寡核苷酸单体聚合得到的单链或双链的寡核苷酸链。3.基因编码化合物，其结构通式如下：其特征在于，所述的结构通式中，n＝3、4，m＝1、2、3、4；优选地，n＝3；m＝1；其中，R1、R2可任选地为羧酸、氢、氨基、硝基、氰基、羟基、巯基、芳基甲酮、烷基甲酮、C1‑
C
12
烷基、C1‑
C6烯烃基、C1‑
C6炔烃基、C3‑
C8环烷基、C1‑
C6烷基氧、芳基、杂环芳基中的任意一种至多种或它们的任意组合；其中，寡聚核酸是由经人工修饰的和/或未修饰的寡核苷酸单体聚合得到的单链或双链的寡核苷酸链。4.一种基因编码化合物库起始头片段化合物与寡聚核酸链接化合物的制备方法，其反应方程式如下：其特征在于，基因编码化合物库起始头片段化合物与寡聚核酸链接得到链接化合物；优选地，对于羧酸类基因编码化合物库起始头片段化合物，与寡聚核酸链接是通过酰胺偶联反应实现的：将寡聚核酸溶于硼酸钠缓冲溶液，并依次将羧酸类基因编码化合物库起始头片段化合物溶液、2
‑
(7
‑
偶氮苯并三氮唑)
‑
N,N,N',N'
‑
四甲基脲六氟磷酸酯溶液、N,N
‑
二异丙基乙胺溶液，加入到寡聚核酸溶液中，在室温下反应至反应结束；和/或对于2,5
‑
二氧杂吡咯烷
‑1‑
基羧酸酯类基因编码化合物库起始头片段化合物，与寡聚核酸链接是通过亲核取代反应实现的：将寡聚核酸溶于硼酸钠缓冲溶液，并将2,5
‑
二氧杂吡咯烷
‑1‑
基羧酸酯类基因编码化合物库起始头片段化合物溶液加入到寡聚核酸溶液中，在室温下反应至反应结束；其中，寡聚核酸是由经人工修饰的和/或未修饰的寡核苷酸单体聚合得到的单链或双链的寡核苷酸链；其中，所述基因编码化合物库起始头片段化合物的结构中，Y包括羧酸类、2,5
‑
二氧杂
吡咯烷
‑1‑
基羧酸酯类，X包括对甲苯磺酰基(OTs)、溴，n＝3、4，m＝1、2、3、4；优选地，Y为2,5
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二氧杂吡咯烷
‑1‑
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【专利技术属性】
技术研发人员：胡允金，杨珂新，杨少光，孙兆美，肖凌倩，薛丽俊，张洁，
申请(专利权)人：康龙化成北京新药技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：