一种猪伪狂犬gE基因缺失灭活疫苗及其生产方法技术

本发明专利技术公开一种猪伪狂犬gE基因缺失灭活疫苗及其生产方法，属于疫苗生产技术领域。本发明专利技术提供的生产方法包括猪伪狂犬gE基因缺失病毒悬浮培养、病毒抗原液澄清、灭活后浓缩纯化和乳化配苗步骤，该方法能够实现猪伪狂犬gE基因缺失病毒大量增殖，提高病毒抗原含量和产量，且有效对病毒液进行灭活处理并降低配苗用抗原液中的杂蛋白含量，各步骤协作可以共同提高疫苗的稳定性、安全性和免疫效力，可以为猪伪狂犬病疫情的防控提供一种安全且免疫效力更强的疫苗产品。更强的疫苗产品。更强的疫苗产品。

【技术实现步骤摘要】
一种猪伪狂犬gE基因缺失灭活疫苗及其生产方法


[0001]本专利技术属于生物医药中疫苗的制备
，具体涉及一种猪伪狂犬gE基因缺失灭活疫苗及其规模化生产方法，尤其涉及一种安全性高、免疫效果好且保存期长的猪伪狂犬gE基因缺失灭活疫苗及其规模化生产方法。

技术介绍

[0002]伪狂犬病是由伪狂犬病毒(Pseudorabies virus，PRV)引起的多种家畜和野生动物的急性传染病。PRV属疱疹病毒科、疱疹病毒亚科，水痘病毒属，具有神经嗜性但对温度、pH值均有较强抵抗力，但对消毒剂较为敏感。PRV可感染除人和无尾猿以外的哺乳动物，猪是该病的主要宿主和传染来源，对猪可呈爆发性流行，引起妊娠母猪流产、死胎，公猪不育，新生仔猪的大量死亡，育肥猪呼吸困难、增长停滞等，是危害全球养猪业的重大传染病之一。
[0003]目前，疫苗免疫是控制猪场PRV疫情的主要手段，其中由于猪PRV基因缺失(尤其是gE基因缺失)灭活疫苗具有安全、免疫效果好、且能够对目前流行的猪伪狂犬病提供保护，并可用相应的ELISA试剂盒区别免疫猪和野毒感染猪等优点，而被广泛生产和应用。例如专利文献CN107267466A(以下称文献1)公开一种大规模生产猪伪狂犬病灭活疫苗的方法，其利用gE基因缺失的猪伪狂犬病毒变异株XF
‑
1株(gE基因缺失株，CN106497890A)，并通过以下步骤规模化制备得到猪伪狂犬gE基因缺失灭活疫苗：(1)猪伪狂犬病病毒XF
‑
1株的制备；(2)猪伪狂犬病病毒的纯化；和(3)将高纯度的猪伪狂犬病毒灭活，经检验合格后，再与疫苗佐剂乳化，并且该文献1证明了其制备的猪伪狂犬gE基因缺失灭活疫苗对仔猪具有良好的免疫保护效果。然而该文献1制备的猪伪狂犬gE基因缺失灭活疫苗的免疫保护效果仍有不足，具体表现在：1)在一次免疫(有效病毒含量为10
7.0
TCID
50
/头份(2ml))后14天和35天检测的平均中和抗体水平(分别为1:9.6和1:45.2)较低；2)在一次免疫(有效病毒含量为10
7.0
TCID
50
/头份(2ml))后35天的攻毒实验中虽然免疫组的实验猪未出现死亡情况，但仍有2/5的实验猪出现发热(>41℃)、精神沉郁、咳嗽、呼吸困难等临床表现。另外该文献1生产过程中使用具有毒性的甲醛作为灭活剂，且采用先浓缩纯化后灭活的生产顺序，其生产的疫苗存在潜在的安全风险。
[0004]童武等人利用猪伪狂犬JS
‑
2012株的gE和gI双基因缺失的毒株(JS
‑
2012
‑△
gI/gE)作为疫苗毒株(猪伪狂犬病基因缺失灭活疫苗(JS
‑
2012
‑△
gI/gE株)的制备及免疫效力评价，中国动物传染病学报，2016,24(6)：12
‑
18，以下称文献2)也制备一种猪伪狂犬基因缺失灭活疫苗，并证明该灭活疫苗能够有效抵抗伪狂犬病毒变异株(JS
‑
2012株)及经典伪狂犬病毒强毒株(SC株)的攻击。然而该文献2制备的猪伪狂犬基因缺失灭活疫苗的免疫保护效果和安全性方面均有不足，具体表现在：1)疫苗接种后会出现个别仔猪短暂性厌食；2)在一次免疫(2ml/头份)的攻毒试验中，有2头猪d3天开始发病，表现精神沉郁、厌食和身体持续性颤栗，其余3头猪有发热(>41℃)，保护率仅为60％；2)在二次免疫(每次2ml/头份)的攻毒试验中，虽然保护率为100％，但是实验猪出现发热(超过40.5℃持续4天)。
[0005]因此，依然很有必要开发免疫效果更好的猪伪狂犬基因缺失灭活疫苗，对于有效控制伪狂犬疫情及伪狂犬净化具有重要意义。

技术实现思路

[0006]针对现有技术中存在的一个或多个问题，本专利技术一个方面提供安全性高、免疫效果好、保存期长的猪伪狂犬gE基因缺失灭活疫苗及其规模化生产方法。具体技术方案如下所示。
[0007]本专利技术的一个方面提供一种猪伪狂犬gE基因缺失灭活疫苗的生产方法，其包括向悬浮培养的BHK
‑
21细胞中接种猪伪狂犬毒株JS
‑
2012株的gE基因缺失毒株JS
‑
2012ΔgE种毒获得病毒液，和对获得的病毒液进行澄清、先灭活后浓缩纯化以及乳化配苗处理生产获得猪伪狂犬gE基因缺失灭活疫苗；其中所述灭活处理中采用BEI作为灭活剂。
[0008]上述生产方法中，所述灭活处理的具体操作为：向经澄清的病毒液中加入BEI，使BEI的终浓度为0.002～0.004mol/L，待温度升至30～35℃时开始计时，灭活24～35小时，期间每隔60～120分钟搅拌一次，计时结束后，使用终浓度为2％～4％的硫代硫酸钠阻断灭活。
[0009]上述生产方法中，所述JS
‑
2012ΔgE种毒的获得方式为：在BHK
‑
21悬浮细胞中连续悬浮培养毒株JS
‑
2012ΔgE至传代12代次以上获得；其中所述培养的条件为：在36.5℃
±
0.5℃，pH值6.5～7.5，搅拌转速80rpm～150rpm，溶解氧浓度30％～60％下培养至细胞活率小于50％或培养48～60小时。
[0010]上述生产方法中，所述悬浮培养的BHK
‑
21细胞的密度为1.8～3.0
×
106个/ml。
[0011]上述生产方法中，所述获得病毒液的具体操作为：按体积百分比为0.5％～1％向悬浮培养的BHK
‑
21细胞中接种JS
‑
2012ΔgE种毒，在36.5℃
±
0.5℃，pH值6.5～7.5，搅拌转速80rpm～150rpm，溶解氧浓度30％～60％下悬浮培养，待细胞活率小于50％时或培养48～60小时收获病毒液。
[0012]上述生产方法中，对病毒液进行澄清、先灭活后浓缩纯化以及乳化配苗处理的具体操作为：
[0013]澄清：将获得的病毒液用已灭菌澄清过滤器(0.45μm)预处理病毒液或用连续流离心机离心，获得病毒澄清液；
[0014]灭活：向病毒澄清液中加入BEI作为灭活剂，使BEI的终浓度为0.002～0.004mol/L，待温度升至30～35℃时开始计时，灭活24～35小时，期间每隔60～120分钟搅拌一次，计时结束后，使用终浓度为2％～4％的硫代硫酸钠阻断灭活，获得灭活病毒液；
[0015]浓缩纯化：用450KD～550KD的中空纤维柱或膜包系统将灭活病毒液进行5～10倍浓缩，再用等体积PBS进行洗滤，取浓缩并洗滤后的病毒液，加入体积浓度为9％～13％的PEG6000后于3～5℃振荡2～6h后静置过夜，经高速冷冻离心(4℃，6000～10000r/min离心20～40min)后，弃掉离心上清，将沉淀用PBS(pH为7.2～7.4，浓度为0.04mol/L)按浓本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种猪伪狂犬gE基因缺失灭活疫苗的生产方法，其包括向悬浮培养的BHK
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21细胞中接种猪伪狂犬毒株JS
‑
2012株的gE基因缺失毒株JS
‑
2012ΔgE种毒获得病毒液，和对获得的病毒液进行澄清、先灭活后浓缩纯化以及乳化配苗处理生产获得猪伪狂犬gE基因缺失灭活疫苗；其中所述灭活处理中采用BEI作为灭活剂。2.根据权利要求1所述的生产方法，其中所述灭活处理的具体操作为：向经澄清的病毒液中加入BEI，使BEI的终浓度为0.002～0.004mol/L，待温度升至30～35℃时开始计时，灭活24～35小时，期间每隔60～120分钟搅拌一次，计时结束后，使用终浓度为2％～4％的硫代硫酸钠阻断灭活。3.根据权利要求1或2所述的生产方法，其中所述JS
‑
2012ΔgE种毒的获得方式为：在BHK
‑
21悬浮细胞中连续悬浮培养毒株JS
‑
2012ΔgE至传代12代次以上获得；其中所述培养的条件为：在36.5℃
±
0.5℃，pH值6.5～7.5，搅拌转速80rpm～150rpm，溶解氧浓度30％～60％下培养至细胞活率小于50％或培养48～60小时。4.根据权利要求1
‑
3中任一项所述的生产方法，其中所述悬浮培养的BHK
‑
21细胞的密度为1.8～3.0
×
106个/ml。5.根据权利要求1
‑
4中任一项所述的生产方法，其中所述获得病毒液的具体操作为：按体积百分比为0.5％～1％向悬浮培养的BHK
‑
21细胞中接种JS
‑
2012ΔgE种毒，在36.5℃
±
0.5℃，pH值6.5～7.5，搅拌转速80rpm～150rpm，溶解氧浓度30％～60％下悬浮培养，待细胞活率小于50...

【专利技术属性】
技术研发人员：李超，宋庆庆，赵丽霞，陈坚，王岩，闫聪，杨波，刘东霞，田志辉，李晓艳，俎红丽，王玉雯，
申请(专利权)人：金宇保灵生物药品有限公司，
类型：发明
国别省市：