靶向EBV的LMP2-mRNA纳米疫苗制造技术

本发明专利技术属于生物医药领域，具体涉及一种LMP2抗原增强型mRNA及其设计方法和应用、一种靶向纳米制剂载体及其制备方法和应用和一种LMP2mRNA脂质体疫苗及其制备方法和应用。所述设计采用MHC

【技术实现步骤摘要】
靶向EBV的LMP2-mRNA纳米疫苗
优先权申请本申请要求2019年7月17提交的中国专利技术专利申请201910648034.4“靶向EBV的LMP2-mRNA纳米疫苗”的优先权，该优先权专利技术专利申请以引用方式全文并入。


[0001]本专利技术属于生物医药领域，具体涉及一种LMP2抗原增强型mRNA及其设计方法和应用、一种靶向纳米制剂载体及其制备方法和应用和一种LMP2-mRNA脂质体疫苗及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]根据国际癌症研究机构的数据，2018年，鼻咽癌新发病例约为12.9万例，占2018年全部确诊病例的0.7％。然而，其全球分布极不平衡，在东亚和东南亚尤为普遍，占新发病例的70％以上。男性鼻咽癌发病率高于女性，2015年中国鼻咽癌发病率比例约为2.5。鼻咽癌以其独特的地理分布为特征，鼻咽癌在生物学、流行病学、组织学、自然史以及治疗反应等方面均不同于其他头颈癌，因而鼻咽癌的治疗有其特殊性。这些发现表明，遗传、种族和环境因素的结合可能会影响鼻咽癌的发病机制。
[0003]放疗是目前治疗鼻咽癌的主要手段，也是未播散的鼻咽癌治疗的基本方式。由于鼻咽部解剖的特殊性，手术不适用于鼻咽癌的初治。但放疗对机体的非特异性损伤巨大。局部复发和远处转移是鼻咽癌治疗失败的两个原因。因此，在常规治疗的基础上迫切需要寻找新的综合治疗手段，近几十年来，随着分子生物学和肿瘤免疫学的研究进展，使用分子生物学手段提高患者细胞免疫，预防鼻咽癌复发和转移并作为传统治疗方法的补充，已受到人们越来越多的重视。<br/>[0004]在恶性肿瘤中病毒性抗原是最具有免疫原性的分子，并且是保护性肿瘤免疫中最具显著意义的肿瘤抗原，EB病毒作为疱疹病毒科成员，是第一个被发现的与人类肿瘤有关的病毒。现已明确EB病毒是导致鼻咽癌、淋巴瘤及免疫抑制后淋巴瘤的主要病因之一。EB病毒表达的潜在膜蛋白LMP1、LMP2发挥多重致瘤作用，可通过激活多重信号转导以及调控各种致肿瘤基因的表达发挥作用。在治疗性疫苗方面，EBV核抗原EBNA1、潜伏膜抗原LMP1和LMP2是主要的治疗靶点。
[0005]LMP2是鼻咽癌等EB病毒相关肿瘤的组织中持续表达的病毒蛋白之一，并且不引起B淋巴细胞转化，体内外研究已证明EB病毒LMP2基因可很好的诱导产生特异性细胞免疫应答。因此，LMP2成为在诱导EB病毒特异性细胞免疫应答、预防和治疗相关肿瘤的良好靶抗原。为引发针对LMP2的特异性细胞免疫应答，就必须首先选择一个适合治疗应用的LMP2表达系统。
[0006]目前针对LMP2的疫苗，只有多肽、DNA疫苗及CTL细胞治疗处于临床研究阶段，而mRNA疫苗未见文献报导。

技术实现思路

[0007]有鉴于此，本专利技术目的之一在于提供一种增强EBV mRNA疫苗免疫原性的方法。该方法具有通用性，可简便的拓展到其他EBV导致的癌症的治疗性mRNA疫苗研发中。
[0008]为实现上述目的，本专利技术采用以下方案：
[0009]一种增强EBV mRNA疫苗免疫原性的方法，其中mRNA的转录模板DNA由启动子、5
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端非翻译区、MHC-I型分子的分泌信号、抗原编码区、跨膜及胞质结构域、3
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端非翻译区、A120和A120后的末端序列依次连接组成。其中，A120的末端序列包括能从polyA末端酶切的限制性酶切位点，包括但不限于BspQI、SapI、EarI等。
[0010]具体的，传统的mRNA转录载体仅由启动子和目的蛋白编码区构成。本专利技术在传统mRNA转录载体设计的基础上添加了免疫原性增强信号(IE)，即：在目的抗原蛋白编码区的两端分别额外添加了MHC-I型分子的分泌信号和跨膜及胞质结构域，以通过增强目的抗原蛋白的抗原提呈效果来增强mRNA疫苗免疫原性。
[0011]其中，所述抗原编码区的序列可以如SEQ ID NO：7-10任一所示及其同一性大于90％的序列。
[0012]所述启动子为T7或SP6启动子。
[0013]进一步，所述5
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端非翻译区的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示及其同义密码子组成的序列，及与上述序列同一性超过90％以上的序列；所述MHC-I型分子的分泌信号包括但不限于来源于不同物种的各类MHC I分子，如：人的MHC I分子(HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F、HLA-G、HLA-H、HLA-K、HLA-I)、小鼠的MHC I分子(H-2D、H-2K、H-2L)、大鼠的MHC I分子、恒河猴的MHC I分子。
[0014]进一步，所述跨膜及胞质结构域的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示及其同义密码子组成的序列，及与上述序列同一性超过90％以上的序列。
[0015]进一步，所述3
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端非翻译区的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示及其同义密码子组成的序列，及与上述序列同一性超过90％以上的序列。
[0016]进一步，A120的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，A120的末端序列的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。
[0017]具体的，试验研究过程中发现，A120的核苷酸序列中polyA的数量介于50～500时，依然可以获得mRNA；其数量介于80～200时，可以获得较稳定的mRNA，但其数量接近120时，稳定性最佳。
[0018]进一步，目的一所述方法所得的mRNA转录模板DNA。
[0019]本专利技术的目的之二在于提供一种LMP2的免疫增强型的EBV mRNA疫苗，所述mRNA疫苗由所述的mRNA转录模板DNA制备。所述疫苗可用于防治以鼻咽癌为代表的一系列由该病毒感染导致的癌症。
[0020]为实现上述目的，本专利技术采用以下方案：
[0021]一种LMP2的免疫增强型的EBV mRNA疫苗，所述mRNA转录模板DNA由启动子、5
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端非翻译区、MHC-I型分子的分泌信号、抗原编码区、跨膜及胞质结构域、3
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端非翻译区、A120和A120后的末端序列依次连接；所述抗原编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示及其同一性超过90％以上的序列。
[0022]进一步，所述mRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示及其同一性超过90％以上的序列。
[0023]进一步，所述的mRNA疫苗制备的靶向纳米制剂载体。
[0024]进一步，所述靶向纳米制剂载体为脂质体载体。
[0025]进一步，所述靶向纳米制剂载体为核-壳纳米粒。
[0026]优选的，所述脂质体载体为阳离子脂质体载体。
[0027]具体的，mRNA极易被体内外广泛存在的mRNA酶降解，选择适宜的载体装载mRNA，一方面可保护其不被mRNA酶降解，另一方面还可能增强其被抗原提呈细胞摄取、甚至可持续表达编码的抗原蛋白，发挥持久的免疫激活作用。因此，本专利技术首先设计和构建了两种具有较好临床转化前景的载体，即阳离子脂本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种增强EBV mRNA疫苗免疫原性的方法，其中模板DNA由启动子、5
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端非翻译区、MHC-I型分子的分泌信号、抗原编码区、跨膜及胞质结构域、3
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端非翻译区、A120和A120后的末端序列依次连接组成。2.根据权利要求1所述的增强EBV mRNA疫苗免疫原性的方法，其特征在于，所述启动子为T7或SP6启动子。3.根据权利要求1所述的增强EBV mRNA疫苗免疫原性的方法，其特征在于，所述5
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端非翻译区的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示及其同义密码子组成的序列，及与上述序列同一性超过90％以上的序列；所述MHC-I型分子的分泌信号包括但不限于来源于不同物种的各类MHC I分子，如：人的MHC I分子(HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F、HLA-G、HLA-H、HLA-K、HLA-I)、小鼠的MHC I分子(H-2D、H-2K、H-2L)、大鼠的MHC I分子、恒河猴的MHC I分子。4.根据权利要求1所述的增强EBV mRNA疫苗免疫原性的方法，其特征在于，所述跨膜及胞质结构域的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示及其同义密码子组成的序列，及与上述序列同一性超过90％以上的序列。5.根据权利要求1所述的增强EBV mRNA疫苗免疫原性的方法，其特征在于，所述3
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端非翻译区的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示及其同义密码子组成的序列，及与上述序列同一性超过90％以上的序列。6.根据权利要求1所述的增强EBV mRNA疫苗免疫原性的方法，其特征在于，A120的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，A120的末端序列的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。7.权利要求1-6任一所述方法所得的mRNA转录模板DNA。8.权利要求7所述的mRNA转录模板DNA制备的mRNA疫苗。9.根据权利要求8所述的mRNA疫苗，其特征在于，所述抗原编码区核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示及其同一性超过90％以上的序列。10.根据权利要求8所述的mRNA疫苗，其特征在于，所述mRNA转录模板DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示及其同一性超过90％以上的序列。11.由权利要求8所述的mRNA疫苗制备的靶向纳米制剂载体。12.根据权利要求11所述的靶向纳米制剂载体，其特征在于，所述靶向纳米制剂载体为脂质体载体。13.根据权利要求11所述的靶向纳米制剂载体，其特征在于，所述靶向纳米制剂载体为阳离子脂质体载体。14.根据权利要求11所述的靶向纳米制剂载体，其特征在于，所述靶向纳米制剂载体为核-壳纳米粒。15.权利要求11所述的靶向纳米制剂载体，其特征在于，所述脂质体载体采用常规脂质体制备方法制备，包括但不限于薄膜水化法、有机溶剂注入法、逆向蒸发法和冻融法。16.根据权利要求11所述的靶向纳米制剂载体，其特征在于，包括磷脂材料、附加剂、有机溶剂；所述磷脂材料包括1,2-二硬脂酰基-3-三甲基铵丙烷、三甲基氯化铵、十八烯酰氧基(乙基-2-十七烯基-3-羟基乙基)咪唑啉鎗、己二酸二癸酯、3-[N-(N
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二甲基氨基乙烷)_氨基甲酰基]胆固醇、二甲基氨基1,2,2-环氧戊氧基丙烷、双十烷基二甲基溴化铵其中的一种或多种；所述附加剂包括总胆固醇、二油酰磷脂酰乙醇胺、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱其中的一种或...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋相容，魏于全，
申请(专利权)人：四川大学华西医院，
类型：发明
国别省市：