疫苗组合物及其制备方法技术

本发明专利技术提出一种疫苗组合物一起制备方法，其中包括由人体中的细胞溶解Ｔ淋巴细胞（ＣＴＬ）识别的即早期型ＨＳＶ－２病毒蛋白质ＩＣＰ２７，并配以一或多种其他的ＨＳＶ蛋白质和合适的辅剂，而该组合物的制备方法是将（ｉ）ＩＣ２７，（ｉｉ）一或多种其他的ＨＳＶ蛋白质和（ｉｉｉ）一或多种辅剂混合。（*该技术在2017年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及治疗及预防疫苗、在这些疫苗中所使用的新型抗原、它们的制备方法及其在人类药品中的使用。具体地说，本专利技术涉及从能够刺激细胞毒性T淋巴细胞应答的单纯疱疹(Herpes Simplex)(HSV)中所得到的抗原。更具体地讲，本专利技术提出治疗或预防处理HSV感染的。HSV会在人体中造成终身感染和复发疾病。有两种密切相关的HSV血清型，它们分别是已知的HSV-1和HSV-2。在最初感染中，在一皮肤或粘膜处重复之后，该病毒移至背根神经节且通常进入一潜伏期。随之，在适当的刺激后重新复活，结果在该神经节所支配的粘膜与皮肤处产生水疱和溃疡。当用中和抗体来防止初期感染和疾病时，它们的存在对复发性疱疹疾病的过程或复发次数没有作用。有T细胞介入的免疫应答，特别是迟发型超敏反应(DTH)或细胞溶解(CTL)效应物类型也已用于在鼠类动物样品中对初期疾病的防护。而且，某些T细胞功能受损的个体可能要经历严重的、有时是有生命危险的疱疹疾病。这些观察说明效应物T细胞功能在控制人体中疱疹病毒的感染方面具有重要作用。人们已提出将单纯疱疹病毒的主要表面糖蛋白，gD和gC用于疫苗中(EP 139417 Genentech)。这些物质主要是刺激中和抗体应答。由于通过CTL进行抗原识别的机理涉及到将天然抗原裂解成肽，把该蛋白水解片断粘接到MHC分子上并且将该络合物输出到该细胞表面，任何编码病毒的多肽(不仅是象糖蛋白那样完整的膜蛋白质)均可以是T细胞应答的一个潜在靶。然而，由于该HSV基因组编码几种非结构蛋白质和内部病毒颗粒蛋白质(除了外部糖蛋白以外)，这就造成了大量潜在的CTL靶，且其中最相关的蛋白质是未知的。HSV感染的特征在于只有极少量的游离病毒存在。在潜伏和复活期，病毒主要是在细胞内。因此，甚至大量的中和抗体也不能防止复发疾病，依靠细胞免疫来控制病毒。所以，为了通过疫苗作用获得保护，人们期望不仅要诱导一种抗体应答，而且还要诱导出CTL。一种有效有疫苗应该是当一出现潜伏病毒的复活信号就能尽早起作用的初始CTL。早期的研究已识别对各种单纯疱疹的结构成分例如糖蛋白gD，gB的人类CTL应答(Zarling等人1986)，但是对于病毒清除这些CTL的实质作用还未知。然而，这种CTL是有限的HLA II类，虽然在HSV重复期间II类分子的表达是在角化细胞中诱导的，但是它可能发生得太晚以致于不能防止该病灶的出现。为了识别出对于预防或治疗的疫苗的目的来说最重要的CTL靶抗原，本专利技术已注意到HSV的重复周期。在初期感染之后和从在神经无神经节中的潜伏状态重现过程中，HSV主要是在细胞内，对于中和抗体它只有最小量的暴露。然而，在包含病毒基因组的细胞内开始病毒蛋白质合成时将产生病毒蛋白质片断，该片断通过在细胞表面的MHC分子而存在，从而使它成为具有适当专一性的CTL的靶。该HSV重现周期持续约18-20小时，且涉及一个α或即早期型(IE)β或早期型(E)和γ或延迟型(L)基因产品的依次表达。所以在延迟型结构基因表达之前的早期型CTL攻击以及随后的所感染的细胞的溶解能够阻止形成新的病毒颗粒，且因此而防止该病毒扩散至相邻的细胞。为了更加有效，CTL应该检测出在感染和重现之后在该细胞内出现的最初的病毒蛋白质。我们已经分析了人类HSV特异性CTL即早期型病毒蛋白质ICP27的专一性。首先我们调查了来自具有不同临床严重程度的疱疹生殖器病灶的病人的周围血单核细胞(PBMC)中的CTL应答。我们使用自体的感染HSV-2的淋巴母细胞作为刺激物来大量诱导HSV-2染异型HLA限制性CTL并限制稀释培养物。在病灶发生之后数天或数周所获得的PBMC样品中发现了强应答。HSV-2特异型CTL的频率范围在1/10000到1/36000之间。使用疫苗病毒重组体ICP27.VV，可以将该基因产物表达在由EBV转化的淋巴母细胞靶细胞中用于细胞毒性试验。该感染重组体的靶细胞通过由在体外用感染HSV-2的淋巴母细胞进行再刺激作用而诱导的HSV-2特异型CTL的一部分而识别出来。所以这种IE蛋白质构成了用来诱导CTL免疫的HSV疫苗的一种候选成分所以，本专利技术涉及一种通过人体中细胞溶解性T淋巴细胞(CTL)而识别的即早期型HSV-2-病毒蛋白质ICP27，具体地说是一种实质上具有如在ID Sequence No.1(蛋白质序列)中所示的序列的ICT27。该术语“实质上”的意思是至少85％为同源的，优选地为90至95％同源，更好地是95％以上为同源。更具体地讲，本专利技术提出一种疫苗组合物，其中包括由人体中的细胞溶解T淋巴细胞(CTL)识别的即早期型HSV-2病毒蛋白质ICP27，并配以一或多种其他的HSV蛋白质和合适的辅剂。本专利技术提供出的疫苗组合物用于治疗或预防处理HSV感染，其中包括HSV-2、即早期型蛋白质ICP27、或其免疫活性片断。该ICP27蛋白质可以作为融合蛋白质而表达，或在一载体上如一乙型肝炎表面抗原上、或通过一种活细菌载体如李氏杆菌、志贺氏菌、BCG或沙门氏菌的形式存在。另外，该蛋白质可以以在一活病毒载体如疫苗、腺病毒或脊髓灰质炎病毒中的形式存在。此外，还可以将该蛋白质送入一种HSV轻质颗粒中，如美国专利申请No.91147140.0和9109763.4(公开于WO 92/13943和PCT LB 92/00824)中所述。ICP27的这些表达形式形成了本专利技术的一部分。本专利技术的一个优选实施方案是一种疫苗重组体，它表达一种HSV-2 ICP27蛋白质或其免疫活性片断。这是这种蛋白质第一次用作为药物，因此本专利技术的一个方面提供了用于药物的HSV-2 ICP27。ICP27是一种即早期型蛋白质，但它在该病毒中的作用尚未被人们很好地理解，但人们已知它对于病毒重现是必需的并涉及病毒基因组转活化作用(transactivation)。作为本文所使用的一种ICP27免疫片断是该蛋白质的一部分，该蛋白质能够诱出功能性免疫应答。在动物模型中，我们已看到在用剧毒的病毒进行初期攻击之后采用表达ICP27的重组疫苗病毒进行接种，实质上减少了该疾病复发的频率及严重程度。本专利技术另一方面提供ICP27 HSV-2蛋白质或其免疫衍生物的制备方法，其中该方法包括在一重组宿主细胞中表达编码所述蛋白质或其衍生物的DNA且回收该产品，且随之可任选地制备它的一种衍生物。一种包括这种编码顺序(如在IDSequence No.2中所示)或其片段的DNA分子构成了本专利技术的进一步的方面，且该分子能通过标准的DNA合成技术进行合成，如用酶结合法，它由D.M.Roberts等人在Biochemistry 1985，24，5090-5098中描述、用化学合成法、用体外酶聚合法、或用这些工艺的结合。关于ID顺序2，成熟蛋白质的编码顺序终止于第1536个碱基。DNA的酶聚合作用可以在体外进行，此时可以在一适当的缓冲液中使用一种DNA聚合酶如DNA聚合I(Klenow片段)，所述的缓冲液要求处于10°-37℃温度下，一般为50ml体积或更少，其中含有三磷酸核苷dATP、dCTP、dGTP、和、dTTP。DNA片断的酶结合法可以使用一种DNA连接酶如T4 DNA连接酶来进行，此时可以在一适合的缓冲液中，例如0.05M Tris本文档来自技高网...

【技术保护点】
疫苗组合物，其中包括由人体中的细胞溶解Ｔ淋巴细胞（ＣＴＬ）识别的即早期型ＨＳＶ－２病毒蛋白质ＩＣＰ２７，并配以一或多种其他的ＨＳＶ蛋白质和合适的辅剂。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：M施劳伊，P帕拉，M库祖科斯，
申请(专利权)人：史密丝克莱恩比彻姆生物有限公司，
类型：发明
国别省市：BE[比利时]