高产N-乙酰基血清素的基因元件组合、重组质粒组合、基因工程菌株和方法技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，特别涉及高产N

【技术实现步骤摘要】
高产N
‑
乙酰基血清素的基因元件组合、重组质粒组合、基因工程菌株和方法


[0001]本专利技术涉及生物
，特别涉及高产N
‑
乙酰基血清素的基因元件组合、重组质粒组合、基因工程菌株和方法。

技术介绍

[0002]N
‑
乙酰血清素，是一种天然存在的化合物，是血清素到褪黑素的内源性合成反应中间体。当今社会生活节奏加快，造成了很多健康问题，而大多数都与N
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乙酰血清素在机体内的产生水平相关，比如压力、缺乏睡眠、营养不良和缺乏锻炼等都可能造成N
‑
乙酰血清素降低，当N
‑
乙酰血清素降低到一定程度将会影响个人计划和组织能力，甚至导致抑郁。研究发现，通过补充N
‑
乙酰血清素能够增强人体免疫力、改善睡眠质量、缓解抑郁，因此，N
‑
乙酰血清素的生产成为了当代社会聚焦的问题。
[0003]当下N
‑
乙酰血清素的合成主要依赖化学法，在生产过程中用到有毒物质，且合成步骤复杂繁琐、副产物过多，所得产物纯度低，这些缺点导致其药用价值偏低，而一种新的方法—生物合成，却能很好地解决上述问题。到目前为止，还未见N
‑
乙酰血清素相关的基因工程菌株。

技术实现思路

[0004]有鉴于此，本专利技术提供了高产N
‑
乙酰基血清素的基因元件组合、重组质粒组合、基因工程菌株和方法。该工程菌生物转化N
‑
乙酰基血清素的产量高达10
‑
20g/L。
[0005]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0006]本专利技术提供了一种高产N
‑
乙酰基血清素的基因元件组合，基因元件组合由基因元件1和基因元件2组成；基因元件1包括5
‑
羟色氨酸脱羧酶基因和芳香烷基胺
‑
N
‑
乙酰基转移酶基因；基因元件2包括分子伴侣基因。
[0007]本专利技术微生物为整合了5
‑
羟色氨酸脱羧酶和芳香烷基胺
‑
N
‑
乙酰基转移酶的基因工程菌株，利用强启动子使5
‑
羟色氨酸脱羧酶和芳香烷基胺
‑
N
‑
乙酰基转移酶在大肠杆菌中共表达，同时利用分子伴侣实现了可溶表达，从而提高了N
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乙酰基血清素产物产量，为利用工程菌株生物转化生产N
‑
乙酰基血清素提供了可行性。
[0008]在本专利技术中，N
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乙酰血清素是5羟基色氨酸在5羟基色氨酸脱羧酶下转化生成5
‑
羟色胺，然后5
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羟色胺在芳香烷基胺
‑
N
‑
乙酰基转移酶下合成的，通过在微生物细胞内重新构建有效的合成途径，使得N
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乙酰血清素的大量合成得以实现。本专利技术通过基因组挖掘出可在大肠杆菌中可溶表达的芳香烷基胺
‑
N
‑
乙酰基转移酶，并通过与分子伴侣共表达，促进新生肽链的正确折叠，大大增加了酶的可溶性表达，显著提升了N
‑
乙酰血清素的产量，为大规模工业化生产N
‑
乙酰血清素提供了支撑。
[0009]作为优选，5
‑
羟色氨酸脱羧酶基因的序列为SEQ ID NO.1所示序列，或者为SEQ ID NO.1所示序列同源性达80％以上的序列；
[0010]作为优选，芳香烷基胺
‑
N
‑
乙酰基转移酶基因的序列为SEQ ID NO.6所示序列，或者为SEQ ID NO.6所示序列同源性达80％以上的序列；
[0011]作为优选，分子伴侣为GroES
‑
GroEL。
[0012]本专利技术还提供了一种高产N
‑
乙酰基血清素的重组质粒组合，重组质粒组合由重组质粒1和重组质粒2组成；重组质粒1包括5
‑
羟色氨酸脱羧酶基因、芳香烷基胺
‑
N
‑
乙酰基转移酶基因和质粒载体；重组质粒2为分子伴侣质粒。
[0013]作为优选，5
‑
羟色氨酸脱羧酶基因的序列为SEQ ID NO.1所示序列，或者为SEQ ID NO.1所示序列同源性达80％以上的序列；
[0014]作为优选，芳香烷基胺
‑
N
‑
乙酰基转移酶基因的序列为SEQ ID NO.6所示序列，或者为SEQ ID NO.6所示序列同源性达80％以上的序列；
[0015]作为优选，分子伴侣质粒为pGro7质粒。
[0016]作为优选，质粒载体为pET28a。
[0017]本专利技术还提供了一种高产N
‑
乙酰基血清素的基因工程菌株，包括上述重组质粒组合及底盘菌株。
[0018]作为优选，底盘菌株为大肠杆菌。
[0019]在本专利技术提供的具体实施例中，底盘菌株为大肠杆菌BL21(DE3)。
[0020]本专利技术还提供了该基因工程菌株的构建方法，将上述重组质粒组合共转入底盘菌株中，得到基因工程菌株。
[0021]本专利技术还提供了一种合成N
‑
乙酰基血清素的方法，包括如下步骤：
[0022](1)将上述基因工程菌株接种至发酵培养基中进行发酵培养；
[0023](2)在发酵培养基中添加诱导剂进行诱导表达，然后添加细胞通透剂进行通透处理；
[0024](3)在发酵培养基中添加底物5
‑
羟基色氨酸进行生物转化，得到N
‑
乙酰基血清素。
[0025]作为优选，诱导剂为IPTG和阿拉伯糖；
[0026]作为优选，细胞通透剂为多粘菌素B、溶菌酶或CT中的一种或多种。
[0027]优选地，细胞通透剂为多粘菌素B。
[0028]作为优选，生物转化的温度为20～45℃，时间为8～50h。
[0029]优选地，生物转化的温度为28～37℃，时间为20～40h。
[0030]更优选地，生物转化的温度为30℃，时间为28h。
[0031]作为优选，步骤(3)中，在发酵培养基中添加底物5
‑
羟基色氨酸的同时添加磷酸吡哆醛。
[0032]作为优选，磷酸吡哆醛的添加量为0.1～10mM。
[0033]优选地，磷酸吡哆醛的添加量为0.5～5mM。
[0034]在本专利技术提供的具体实施例中，发酵培养基(质量百分比)为1.2％胰蛋白胨、2.4％酵母提取物、0.5％甘油、0.231％KH2PO4和1.64％K2HPO4·
3H2O。
[0035]作为优选，发酵培养基的培养条件为28～40℃，160～230rpm。
[0036]优选地，发酵培本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高产N
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乙酰基血清素的基因元件组合，其特征在于，所述基因元件组合由基因元件1和基因元件2组成；所述基因元件1包括5
‑
羟色氨酸脱羧酶基因和芳香烷基胺
‑
N
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乙酰基转移酶基因；所述基因元件2包括分子伴侣基因。2.根据权利要求1所述基因元件组合，其特征在于，所述5
‑
羟色氨酸脱羧酶基因的序列为SEQ ID NO.1所示序列，或者为SEQ ID NO.1所示序列同源性达80％以上的序列；所述芳香烷基胺
‑
N
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乙酰基转移酶基因的序列为SEQ ID NO.6所示序列，或者为SEQ ID NO.6所示序列同源性达80％以上的序列；所述分子伴侣为GroES
‑
GroEL。3.一种高产N
‑
乙酰基血清素的重组质粒组合，其特征在于，所述重组质粒组合由重组质粒1和重组质粒2组成；所述重组质粒1包括5
‑
羟色氨酸脱羧酶基因、芳香烷基胺
‑
N
‑
乙酰基转移酶基因和质粒载体；所述重组质粒2为分子伴侣质粒。4.根据权利要求3所述的重组质粒组合，其特征在于，所述5
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羟色氨酸脱羧酶基因的序列为SEQ ID NO.1所示序列，或者为SEQ ID NO.1所示序列同源性...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨志彬，田俊波，李迁，崔金旺，邢瑞静，张永刚，
申请(专利权)人：河北维达康生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：