鄞红葡萄磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶PEPCK基因、其扩增引物及应用制造技术

本发明专利技术公开了鄞红葡萄磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶PEPCK基因、用于扩增鄞红葡萄磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶PEPCK基因的引物、用于鄞红葡萄磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶PEPCK基因荧光定量RT

【技术实现步骤摘要】
鄞红葡萄磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶PEPCK基因、其扩增引物及应用


[0001]本专利技术涉及生物
，具体是一种鄞红葡萄磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶PEPCK基因、其扩增引物及应用。

技术介绍

[0002]葡萄(Vitis vinifera)是一种重要的栽培果树，其种植面积及产量均居世界前列。我国是世界上主要的葡萄种植国家，其中我国南方主要以鲜食葡萄的栽培为主。鲜食葡萄的经济价值主要体现在品质上，由于糖酸比适宜的葡萄品质具有口感幽美、清新爽口等优点，因此葡萄果实内的糖份与有机酸的含量和比例是影响其品质的主要因素。“鄞红”葡萄为优良鲜食品种，其果实中的糖酸比为35，处于适宜糖酸比的区间内，因此具有优秀的品质。
[0003]研究显示果实成熟过程中积累的有机酸可以通过糖异生途径转变为糖。糖异生是一个广泛存在于植物中的代谢途径，其主要功能为将植物中的非糖类物质如有机酸、脂类等转化为糖类物质。磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)是糖异生代谢途径中关键的调控因子，其功能为催化草酰乙酸脱羧形成磷酸烯醇式丙酮酸。不同种类植物中PEPCK的功能有所不同，主要由于其序列有一定的差别，体现在氨基酸序列的N端，说明PEPCK基因序列对其功能的影响较大。
[0004]现研究表明在一些水果(包括西红柿、蓝莓和红浆果)的果肉中PEPCK对糖酸含量的变化有重要的调控作用，但对“鄞红”葡萄中相关PEPCK基因的研究以及PEPCK基因对果实成熟过程中糖酸含量调控的研究还没有报道，因此对“鄞红”葡萄PEPCK基因的克隆及其他分子研究尤为重要。

技术实现思路

[0005]本专利技术所要解决的技术问题是，针对现有技术的不足，提供一种鄞红葡萄磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶PEPCK基因、其扩增引物及应用。
[0006]本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案为：鄞红葡萄磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶PEPCK基因，该基因的编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，全长氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0007]PEPCK基因的编码区的核苷酸序列的克隆方法包括以下步骤：
[0008]首先，采用多糖多酚植物总RNA提取试剂盒提取鄞红葡萄果肉总RNA，采用NanoDrop2000微量核酸蛋白分析仪(Thermo Fisher，USA)和DYCP
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31BN型琼脂糖水平电泳仪分析RNA完整性、含量并检测纯度；
[0009]其次，从GenBank中下载与葡萄属植物亲缘关系相近植物的PEPCK基因全长序列，采用ClustalW进行多序列比对，找出PEPCK基因的编码区序列，利用Primer 5.0设计引物Kl
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PERPCK
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F和Kl
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PEPCK
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R进行PCR扩增，引物Kl
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PERPCK
‑
F和Kl
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PEPCK
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R的序列分别为：
[0010]Kl
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PERPCK
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F：GTTTTGTTTCCCACTCAG；
[0011]Kl
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PEPCK
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R：TTATGAGGGTTTACTCTTGAACTTCC；
[0012]使用SuperRT cDNA第一链合成试剂盒(CWBIO，China)将鄞红葡萄总RNA逆转录为cDNA，并将cDNA保存于
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20℃冰箱中备用；
[0013]使用Primer软件设计特异性引物，命名为Kl
‑
PERPCK并采用巢式PCR技术对PEPCK序列进行扩增，首先使用2
×
Flash Hot Start MasterMix(Dye)(CWBIO，China)扩增酶对PEPCK进行第一步扩增，反应体系与制作方法参考说明书；将第一步扩增所得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，使用NuceloSpin Gel and PCR Clean
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Up Kit试剂盒(Aidlab，China)对目标条带进行回收；将回收的条带使用2
×
Fast Pfu Master Mix高保真酶进行第二步PCR扩增，反应体系与制作方法参考说明书；将第二步扩增所得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳；使用NuceloSpin Gel and PCR Clean
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Up Kit试剂盒(Aidlab，China)对目标条带进行回收，得到目的片段；将目的片段连接PMD18
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载体并转入大肠杆菌DH5α感受态细胞，利用菌液PCR检测阳性克隆，并送擎科生物科技有限公司(上海)进行序列测定，获得鄞红葡萄PEPCK基因编码区的核苷酸序列，即SEQ ID NO.1；使用DNAMEN软件对SEQ ID NO.1进行分析，得到鄞红葡萄PEPCK基因的全长氨基酸序列即SEQ ID NO.2。
[0014]进一步地，该基因的编码区的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个碱基且具有磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶活性的基因序列。
[0015]进一步地，该基因的全长氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基且具有磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶活性的由SEQ ID NO.2衍生的蛋白质。
[0016]用于扩增鄞红葡萄磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶PEPCK基因的引物，包括用于扩增SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的引物组Kl
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PERPCK
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F和Kl
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PEPCK
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R，该引物组的序列为：
[0017]Kl
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PERPCK
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F：GTTTTGTTTCCCACTCAG；
[0018]Kl
‑
PEPCK
‑
R：TTATGAGGGTTTACTCTTGAACTTCC。
[0019]用于鄞红葡萄磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶PEPCK基因荧光定量RT
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qPCR的引物，包括引物组YgPEPCK
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F、ygPEPCK
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R、N2
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F和N2
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R，其中N2
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F和N2
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R为内参基因引物，该引物组的序列为：
[0020]YgPEPCK
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F：ACCTGTGAGCAAACTGAACC；
[0021]ygPEPCK
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R：ATGTTGCTTGTGGCTCCTT；
[0022]N2
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F：CAAGAGAAACCATCCCTAGCTG；
[0023]N2
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R：TCAATCTGTCTAGGAAAGGAAG。
[0024]上述鄞红葡萄磷酸烯醇式丙酮酸羧本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.鄞红葡萄磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶PEPCK基因，其特征在于，该基因的编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，全长氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。2.根据权利要求1所述的鄞红葡萄磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶PEPCK基因，其特征在于，该基因的编码区的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个碱基且具有磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶活性的基因序列。3.根据权利要求2所述的鄞红葡萄磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶PEPCK基因，其特征在于，该基因的全长氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基且具有磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶活性的由SEQ ID NO.2衍生的蛋白质。4.用于扩增鄞红葡萄磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶PEPCK基因的引物，其特征在于，包括用于扩增SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的引物组Kl
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PERPCK
‑
F和Kl
‑
PEPCK
‑
R，该引物组的序列为：Kl
‑
PERPCK
‑
F：GTTTTGTTTCCCACTCAG；Kl
‑
PEPC...

【专利技术属性】
技术研发人员：王锦阳，吴月燕，
申请(专利权)人：浙江万里学院，
类型：发明
国别省市：