嗜氢菌属细菌转化体制造技术

通过向嗜氢菌(hydrogenophilus)属细菌导入(a1)、(a2)或(a3)的DNA和(b)醇脱氢酶的基因而获得的这种转化体可以利用二氧化碳作为唯一的碳源来有效制造异丁醇。DNA(a1)包含SEQ ID No:1表示的碱基序列。DNA(a2)包含与SEQ ID NO:1具有至少90％同一性的碱基序列，并编码具有2

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】putida)adh基因或大肠杆菌(Escherichia coli)adhP基因用作醇脱氢酶基因。
[0010]另外，使用仅导入2-酮酸脱羧酶基因和醇脱氢酶基因的转化体来生成异丁醇的各种方法是已知的。
[0011]非专利文献1教导了通过将乳酸乳球菌kivD基因和酿酒酵母adh2基因导入大肠杆菌中获得的转化体的用途。
[0012]非专利文献2教导了通过将乳酸乳球菌kivD基因和乳酸乳球菌adhA基因导入大肠杆菌中获得的转化体的用途。
[0013]非专利文献3教导了通过将乳酸乳球菌kivD基因和酿酒酵母adh2基因导入枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中获得的转化体的用途。
[0014]非专利文献4教导了通过将乳酸乳球菌kivD基因和富养劳氏菌(Ralstonia eutropha)adh基因导入奥奈达希瓦氏菌(Shewanella oneidensis)中获得的转化体的用途。
[0015]非专利文献5教导了通过将乳酸乳球菌kivD基因和大肠杆菌yqhD基因导入蓝细菌细长聚球藻(Synechococcus elongatus)中获得的转化体的用途。
[0016]非专利文献6教导了通过将乳酸乳球菌kivD基因和富养劳氏菌adh基因的过表达质粒导入富养劳氏菌中获得的转化体的用途。
[0017]非专利文献7教导了通过将乳酸乳球菌kivD基因和热葡糖苷酶地芽孢杆菌(Geobacillus thermoglucosidasius)adhA基因的过表达质粒导入热葡糖苷酶地芽孢杆菌中获得的转化体的用途。
[0018]除使用乳酸乳球菌kivD基因的方法外，将枯草芽孢杆菌alsS基因、热葡糖苷酶地芽孢杆菌Geoth_3495基因、嗜热脱氮地芽孢杆菌(Geobacillus thermodenitrificans)Gtng_0348基因、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)ipdC基因或表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)ipdC基因用作2-酮酸脱羧酶基因的方法也是已知的。然而，与后5个基因相比，乳酸乳球菌kivD基因在宿主内通常产生更高的酶活性，因此，常规上主要使用乳酸乳球菌kivD基因。
[0019]几乎所有上述方法都是利用糖作为碳源生成异丁醇的方法，而不是利用二氧化碳作为碳源生成异丁醇的方法。
[0020]非专利文献5的方法使用蓝细菌作为宿主，蓝细菌是一种光合细菌。该方法利用碳酸氢钠作为碳源制造异丁醇。蓝细菌具有比植物更高的二氧化碳固定能力。但是，由于蓝细菌的二氧化碳固定能力不足，利用蓝细菌作为宿主的方法尚未作为制造异丁醇的工业方法投入实际应用。
[0021]乙醇的制造
[0022]常规上，许多用于燃料、化工原料、饮料等的乙醇是通过利用微生物来发酵源自于各种生物质资源的淀粉或糖类而制造的。
[0023]作为利用重组微生物生产乙醇的方法，使用通过导入催化使丙酮酸脱羧生成乙醛的反应的丙酮酸脱羧酶(以下可称为“PDC”)(EC4.1.1.1)基因、和/或导入催化从乙醛到乙醇的反应的醇脱氢酶(以下称为“ADH”)(EC 1.1.1.1)基因而获得的转化体的方法，是已知的。
[0024]许多常规方法使用通过导入产生PDC的基因和产生ADH的基因而获得的转化体，这
两种基因均源自于运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)。例如，专利文献2教导了通过将源自于运动发酵单胞菌的pdc基因和adhB基因导入肠细菌例如大肠杆菌中获得的转化体有效生成乙醇。
[0025]作为利用其他细菌的PDC和ADH基因的方法，非专利文献8公开了使用通过将胃八叠球菌(Sarcina ventriculi)pdc基因和短乳杆菌(Lactobacillus brevis)adh基因导入大肠杆菌中获得的转化体来制造乙醇的方法。
[0026]另外，非专利文献9公开了使用通过将胃八叠球菌pdc基因和嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearotherophilophilus)adh基因导入巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)中获得的转化体来制造乙醇的方法。
[0027]除上述丙酮酸脱羧酶基因外，还已知可利用氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)、重氮营养葡糖醋杆菌(Gluconoacetobacter diazotrophicus)、巴氏醋杆菌(Acetobacter pasteurianus)、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)和棕榈发酵细菌(Zymobacter palmae)的丙酮酸脱羧酶基因。此外，除上述醇脱氢酶基因外，还已知利用了多种微生物物种的醇脱氢酶基因。
[0028]然而，那些文献中记载的方法是利用糖作为碳源生成乙醇的方法，而不是利用二氧化碳作为碳源生成乙醇的方法。
[0029]作为利用二氧化碳作为碳源生成乙醇的方法，使用光合细菌蓝细菌作为宿主的方法是已知的。例如，非专利文献10公开了使用通过将源自于运动发酵单胞菌的pdc和adhB基因导入聚球藻(Synechococcus)属细菌中获得的转化体来制造乙醇的方法。
[0030]另外，非专利文献11公开了使用通过将运动发酵单胞菌pdc基因和集胞藻(Synechocystis)属细菌的NADPH依赖性ADH基因(slr1192)导入聚球藻属细菌中获得的转化体来制造乙醇的方法。
[0031]如上面提到的，蓝细菌的二氧化碳固定能力不足以用于工业利用，因此，尚没有使用蓝细菌作为宿主的方法作为乙醇工业制造方法投入实际应用。
[0032]此外，作为使用重组微生物制造乙醇的方法，使用通过导入催化从乙酰辅酶A经乙醛生成乙醇的反应的醛-醇脱氢酶基因而获得的转化体的方法也是已知的。
[0033]从乙酰辅酶A经乙醛生成乙醇的反应对于在厌氧条件下生产乙醇很重要，因此，当使用在厌氧条件下生长的微生物作为宿主生产醇时，通常使用醛-醇脱氢酶基因。
[0034]例如，非专利文献12教导了使用通过将一种醛-醇脱氢酶基因——adehE基因导入在厌氧条件下生长的激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)中获得的转化体来制造乙醇的方法。
[0035]另外，非专利文献13教导了使用通过将adhE基因导入在厌氧条件下生长的Caldicellulosiruptor bescii中获得的转化体来制造乙醇的方法。
[0036]然而，在那些文献中记载的这些方法是利用糖作为碳源生成乙醇的方法，而不是利用二氧化碳作为碳源生成乙醇的方法。
[0037]丙氨酸的制造
[0038]丙氨酸是一种作为医药、食品或化学工业原料的重要的氨基酸，并且对丙氨酸的需求在不断增加。丙氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.1)已用于制造丙氨酸。该酶催化由丙酮酸、氨和NADH生成丙氨酸的反应。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.下述(a1)、(a2)或(a3)的DNA：(a1)由SEQ ID NO:1的碱基序列组成的DNA；(a2)由与SEQ ID NO:1具有90％以上同一性的碱基序列组成的DNA，所述DNA编码具有2-酮酸脱羧酶活性的多肽；(a3)在严格条件下与由SEQ ID NO:1的互补碱基序列组成的DNA杂交并且编码具有2-酮酸脱羧酶活性的多肽的DNA。2.一种转化体，其通过将(a)根据权利要求1所述的DNA和(b)醇脱氢酶基因导入嗜氢菌(Hydrogenophilus)属细菌中获得。3.根据权利要求2所述的转化体，其中所述醇脱氢酶基因(b)是下述(b1)、(b2)、(b3)、(b4)、(b5)或(b6)的DNA：(b1)由SEQ ID NO:2、3、4或5的碱基序列组成的DNA；(b2)由与SEQ ID NO:2、3、4或5具有90％以上同一性的碱基序列组成的DNA，所述DNA编码具有醇脱氢酶活性的多肽；(b3)在严格条件下与由SEQ ID NO:2、3、4或5的互补碱基序列组成的DNA杂交并且编码具有醇脱氢酶活性的多肽的DNA；(b4)由SEQ ID NO:6、7、8或9的氨基酸序列组成的多肽的编码DNA；(b5)由与SEQ ID NO:6、7、8或9具有90％以上同一性的氨基酸序列组成的多肽的编码DNA，所述多肽具有醇脱氢酶活性；(b6)由在SEQ ID NO:6、7、8或9的氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸的缺失、取代或添加的氨基酸序列组成的多肽的编码DNA，所述多肽具有醇脱氢酶活性。4.根据权利要求2或3所述的转化体，其中所述嗜氢菌属细菌是Hydrogenophilus thermoluteolus。5.一种制造异丁醇的方法，所述方法包括在使用二氧化碳作为基本上唯一碳源的同时，培养根据权利要求2至4中任一项所述的转化体的步骤。6.一种转化体，其通过将(c)下述(c1)、(c2)、(c3)、(c4)、(c5)或(c6)的丙酮酸脱羧酶基因和(b)醇脱氢酶基因导入嗜氢菌属细菌中获得：(c1)由SEQ ID NO:10的碱基序列组成的DNA；(c2)由与SEQ ID NO:10具有90％以上同一性的碱基序列组成的DNA，所述DNA编码具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽；(c3)在严格条件下与由SEQ ID NO:10的互补碱基序列组成的DNA杂交并且编码具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽的DNA；(c4)由SEQ ID NO:11的氨基酸序列组成的多肽的编码DNA；(c5)由与SEQ ID NO:11具有90％以上同一性的氨基酸序列组成的多肽的编码DNA，所述多肽具有丙酮酸脱羧酶活性；(c6)由在SEQ ID NO:11的氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸的缺失、取代或添加的氨基酸序列组成的多肽的编码DNA，所述多肽具有丙酮酸脱羧酶活性。7.根据权利要求6所述的转化体，其中所述醇脱氢酶基因(b)是下述(b1)、(b2)、(b3)、(b4)、(b5)或(b6)的DNA：(b1)由SEQ ID NO:2、3、4或5的碱基序列组成的DNA；
(b2)由与SEQ ID NO:2、3、4或5具有90％以上同一性的碱基序列组成的DNA，所述DNA编码具有醇脱氢酶活性的多肽；(b3)在严格条件下与由SEQ ID NO:2、3、4或5的互补碱基序列组成的DNA杂交并且编码具有醇脱氢酶活性的多肽的DNA；(b4)由SEQ ID NO:6、7、8或9的氨基酸序列组成的多肽的编码DNA；(b5)由与SEQ ID NO:6、7、8或9具有90％以上同一性的氨基酸序列组成的多肽的编码DNA，所述多肽具有醇脱氢酶活性；(b6)由在SEQ ID NO:6、7、8或9的氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸的缺失、取代或添加的氨基酸序列组成的多肽的编码DNA，所述多肽具有醇脱氢酶活性。8.根据权利要求6或7所述的转化体，其中所述嗜氢菌属细菌是Hydrogenophilus thermoluteolus。9.一种制造乙醇的方法，所述方法包括在使用二氧化碳作为基本上唯一碳源的同时，培养根据权利要求6至8中任一项所述的转化体的步骤。10.一种转化体，其通过将(d)醛-醇脱氢酶基因导入嗜氢菌属细菌中获得。11.根据权利要求10所述的转化体，其中所述醛-醇脱氢酶基因(d)是下述(d1)、(d2)、(d3)、(d4)、(d5)、(d6)、(d7)、(d8)或(d9)的DNA：(d1)由SEQ ID NO:12或13的碱基序列组成的DNA；(d2)由与SEQ ID NO:12或13具有90％以上同一性的碱基序列组成的DNA，所述DNA编码具有醛-醇脱氢酶活性的多肽；(d3)在严格条件下与由SEQ ID NO:12或13的互补碱基序列组成的DNA杂交并且编码具有醛-醇脱氢酶活性的多肽的DNA；(d4)由SEQ ID NO:14或15的氨基酸序列组成的多肽的编码DNA；(d5)由与SEQ ID NO:14或15具有90％以上同一性的氨基酸序列组成的多肽的编码DNA，所述多肽具有醛-醇脱氢酶活性；(d6)由在SEQ ID NO:14或15的氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸的缺失、取代或添加的氨基酸序列组成的多肽的编码DNA，所述多肽具有醛-醇脱氢酶活性；(d7)由SEQ ID NO:16、17、18、19、20、21、22、23或24的氨基酸序列组成的多肽的编码DNA；(d8)由与SEQ ID NO:16、17、18、19、20、21、22或23具有90％以上同一性的氨基酸序列组成的多肽的编码DNA(条件是所述多肽中氨基酸编号568的氨基酸是Lys、Ala、Leu、Asn、Gly、Ser、Arg或His)，所述多肽具有醛-醇脱氢酶活性，或者由与SEQ ID NO:24具有90％以上同一性的氨基酸序列组成的多肽的编码DNA(条件是所述多肽中氨基酸编号575的氨基酸是Asn)，所述多肽具有醛-醇脱氢酶活性；(d9)由在SEQ ID NO:16、17、18、19、20、21、22或23的氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸的缺失、取代或添加的氨基酸序列组成的多肽的编码DNA(条件是所述多肽中氨基酸编号568的氨基酸是Lys、Ala、Leu、A...

【专利技术属性】
技术研发人员：汤川英明，大谷直人，石井正治，
申请(专利权)人：国立大学法人东京大学，
类型：发明
国别省市：