高产IAA绿色木霉工程菌株及其构建方法与应用技术

本发明专利技术提供高产IAA绿色木霉工程菌株及其构建方法与应用，属于微生物技术领域。本发明专利技术从绿色木霉(Trichoderma viride)Tv

【技术实现步骤摘要】
高产IAA绿色木霉工程菌株及其构建方法与应用


[0001]本专利技术属于微生物
，具体涉及高产IAA绿色木霉工程菌株及其构建方法与应用。

技术介绍

[0002]公开该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
[0003]化肥的滥用导致环境污染问题趋于严重，农药和化肥的残留，向环境释放大量有害物质，污染土壤、水源和食品，对人类健康及生存环境构成极大威胁，因此研制出能够降低化肥用量，符合农业可持续发展的新型肥料十分必要。植物和植物根际土壤存在大量促生菌可使土壤无效营养有效化加强养分利用率，并可产生利于植物生长的代谢产物。
[0004]吲哚乙酸(indole
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acetic acid，简称IAA)是产生调节植物生长素的信号物质，也是在植物体内普遍存在的生长素物质。它对植物最明显的作用是促进细胞生长，使细胞的体积和重量增加，还具有促进细胞分裂和分化，调节生根等生理功能。
[0005]自1977年科学家发现巴西固氮螺菌能合成IAA后，更多研究发现，土壤中约50％以上的细菌可以产生IAA。
[0006]木霉(Trichoderma spp.)是一类重要的多功能丝状真菌，是农业生产中重要的生防菌株和植物促生菌株。木霉代谢产物中含有多种植物生长激素，如：细胞分裂素(CTK)、生长素(IAA)、赤霉素(GA3)、脱落酸(ABA)等，它们可调控植株的很多代谢过程。
>[0007]国内外一些实验都证实了木霉菌可通过产生吲哚乙酸(IAA)来促进植株生长。绿木霉(T.virens)代谢产生的吲哚乙酸(IAA)，使拟南芥的鲜重增加了62％。另外，从康氏木霉(T.koningii)及哈茨木霉(T.harzianum)的代谢物中分离纯化出来的类植物生长素6
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‑2‑
one)也能促进小麦胚芽鞘、油菜及番茄幼苗的生长。
[0008]IAA的生物合成主要通过色氨酸依赖型的途径，依据IAA合成的中间产物不同，划分成4条支路:吲哚乙醛肟途径、吲哚丙酮酸途径、色胺途径和吲哚乙酰胺途径。近年来，很多与生长素合成相关的重要催化酶系和关键调控基因都被鉴定和克隆。其中色氨酸脱羧酶(L
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Tryptophan decarboxylase，TDC)是色胺途径中重要的催化酶之一。
[0009]同时，作为IAA合成的重要前体，色氨酸的合成和含量也是影响IAA产生的关键因素。经分支酸合成色氨酸的代谢途径包含五步反应，由多种催化酶的参与。其中催化最后一步合成的色氨酸合成酶(tryptophan synthase，TRPS)，是异四聚体结构，由trpA和trpB基因编码的alpha亚基和beta亚基组成。在色氨酸代谢工程育种中，色氨酸合成酶是影响色氨酸产率的重要限速酶之一。
[0010]利用基因组分析和基因工程技术，调控木霉中重要代谢产物的表达是提高木霉抗逆性、促生能力的有效途径。构建筛选具有高效产生IAA的木霉工程菌株可为促生生物肥料的研发等提供出发菌株，对促进木霉菌在农业生产中的应用具有重要意义。

技术实现思路

[0011]为了克服上述技术问题，本专利技术提供高产IAA绿色木霉工程菌株及其构建方法与应用，本专利技术从绿色木霉(Trichoderma viride)Tv
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1511基因组中鉴定出分别编码色氨酸合成酶和色氨酸脱羧酶的编码基因，并成功构建了TvTRPS和/或TvTDC过表达的绿色木霉工程菌(TvTRPS
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OE、TvTDC
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OE和TvTRPS/TDC
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OE)，经试验证明，所构建的三种绿色木霉工程菌与原始木霉菌株相比，其生产IAA的能力显著增强，同时具有更强的抗逆和植物促生能力，能够促进木霉菌在农业生产中的应用，因此具有良好的实际应用之价值。
[0012]为实现上述技术目的，本专利技术采用的技术方案如下：
[0013]本专利技术的第一个方面，提供一种酶编码基因，所述基因包括色氨酸合成酶(TvTRPS)编码基因和/或色氨酸脱羧酶(TvTDC)编码基因，所述基因具有(a1)
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(a3)中任一所述核苷酸序列：
[0014](a1)SEQ ID NO.1和/或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；
[0015](a2)与(a1)互补的核苷酸序列；
[0016](a3)与(a1)或(a2)所示的核苷酸序列具有≥90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(完全)序列)一致性且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。
[0017]本专利技术的第二个方面，提供一种酶，其包含色氨酸合成酶TvTRPS和/或海藻糖磷酸酶TvTDC，氨基酸序列为如下(b1)或(b2)：
[0018](b1)SEQ ID NO.3和/或SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0019](b2)将(b1)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同生物活性的由其衍生的蛋白质。
[0020]本专利技术的第三个方面，基于上述酶编码基因所设计的扩增引物、含有上述酶编码基因的重组表达载体和/或含有上述酶编码基因的工程菌亦在本专利技术的保护范围之内。
[0021]其中，所述扩增引物包括SEQ ID NO.5
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8所示序列。
[0022]所述重组表达载体通过上述基因有效地连接到表达载体上获得，所述表达载体为病毒载体、质粒、噬菌体、噬菌粒、黏粒、F黏粒、噬菌体或人工染色体中的任意一种或多种；病毒载体可包括腺病毒载体、逆转录病毒载体或腺伴随病毒载体，人工染色体包括细菌人工染色体(BAC)、噬菌体P1衍生的载体(PAC)、酵母人工染色体(YAC)或哺乳动物人工染色体(MAC)；进一步优选为真菌质粒；更进一步优选为pBARGPE1
‑
Hygro质粒；
[0023]所述工程菌包括但不限于细菌和真菌，进一步选自埃希氏大肠杆菌、芽孢杆菌、酿酒酵母、绿色木霉和草酸青霉；更进一步优选为绿色木霉，所述绿色木霉可以是绿色木霉(Trichoderma viride)Tv
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1511，其在中国普通微生物菌种保藏中心的保藏号为CGMCC No.16800，保藏日期为2018年12月04日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。该菌株已在授权专利(CN110218659B)中公开。
[0024]本专利技术成功构建了TvTRPS和/或TvTDC过表达的绿色木霉工程菌即TvTRPS
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OE、TvTDC
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OE和TvTRPS/TDC
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种酶编码基因，所述基因包括色氨酸合成酶(TvTRPS)编码基因和/或色氨酸脱羧酶(TvTDC)编码基因，所述基因具有(a1)
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(a3)中任一所述核苷酸序列：(a1)SEQ ID NO.1和/或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；(a2)与(a1)互补的核苷酸序列；(a3)与(a1)或(a2)所示的核苷酸序列具有≥90％一致性且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。2.一种酶，其包含色氨酸合成酶TvTRPS和/或海藻糖磷酸酶TvTDC，氨基酸序列为如下(b1)或(b2)：(b1)SEQ ID NO.3和/或SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b2)将(b1)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同生物活性的由其衍生的蛋白质。3.含有权利要求1所述的酶编码基因的重组表达载体。4.如权利要求3所述重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体通过权利要求1所述基因有效地连接到表达载体上获得；优选的，所述表达载体为病毒载体、质粒、噬菌体、噬菌粒、黏粒、F黏粒、噬菌体或人工染色体中的任意一种或多种；进一步优选为真菌质粒；更进一步优选为pBARGPE1
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Hygro质粒。5.含有权利要求1所述的酶编码基因的工程菌。6.如权利要求5所述的工程菌，其特征在于，所述工程菌包括细菌和真菌，进一步优选选自埃希氏大肠杆菌、芽孢杆菌、酿酒酵母、绿色木霉和草酸青霉；更进一步优选为绿色木霉。7.权利要求1所述酶编码基因的获得方法，其特征在于，通过人工合成或者以绿色木霉(Trichoderma viride)Tv
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1511的基因组DNA或cDNA为模板，使用引物扩增获得；优选的，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：李哲，张豪，郭凯，隋永辉，黄艳华，郝永任，
申请(专利权)人：山东省科学院生物研究所，
类型：发明
国别省市：