一种内切褐藻胶裂解酶、其编码基因及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种内切褐藻胶裂解酶、其编码基因及应用。本发明专利技术以弧菌Vibriosp.MCCC 1A13243的基因组DNA为模板，设计并合成引物，通过PCR扩增内切褐藻胶裂解酶基因,将该基因克隆入pET

【技术实现步骤摘要】
一种内切褐藻胶裂解酶、其编码基因及应用


[0001]本专利技术涉及采用基因工程手段获得一种内切褐藻胶裂解酶及其制备方法，属于生物工程


技术介绍

[0002]褐藻胶是一类主要从褐藻细胞壁中提取的水溶性酸性多糖，它是由β
‑
D
‑
甘露糖醛酸(M)和α
‑
L
‑
古罗糖醛酸(G)两种单体随机排列组成的多聚物，这两种单体通过1，4
‑
糖苷键连接能形成三种不同形式的多糖片段：聚β
‑
D
‑
甘露糖醛酸(Polymannuronic acid，PolyM)片段、聚α
‑
L
‑
古罗糖醛酸(Polyguluronic acid，PolyG)片段以及二者杂合片段(PolyMG)。褐藻胶因其具有抗肿瘤、降血压等生理活性，被广泛应用于食品、医疗、农业、能源等方面。
[0003]目前生物酶法是降解褐藻胶的重要方法，相较于会污染环境、低效率、反应条件难以控制的化学和物理降解法，生物酶法具有反应条件温和可控、专一性强等优势。褐藻胶裂解酶可通过β
‑
消除反应将褐藻胶降解为一系列不饱和糖醛酸寡糖和单体，这些降解产物具有促进植物生长、缓解植物胁迫、抗炎、抑菌、抗肿瘤及抗氧化等生理活性，因此，褐藻寡糖的生产极为重要。按照作用方式不同，褐藻胶裂解酶分为内切型和外切型两种。到目前为止，在CAZy(Carbohydrate
‑
Active Enzymes)数据库中，褐藻胶裂解酶分属于12个多糖裂解酶家族(Polysaccharide Lyases，PLs)，包括PL5、PL6、PL7、PL14、PL15、PL17、PL18、PL31、PL32、PL34、PL36和PL39。
[0004]褐藻胶裂解酶来源广泛，目前在藻类、细菌、海洋软体动物、真菌和病毒中均有发现。微生物来源的褐藻胶裂解酶种类最为丰富，这些微生物包括弧菌属(Vibrio)，假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)，微泡菌属(Microbulbifer)，黄杆菌属(Flavobacterium)，芽孢杆菌属(Bacillus)和链霉菌属(Streptomyces)等的成员。
[0005]随着基因组测序技术的发展，越来越多的褐藻胶裂解酶基因被注释出来，通过基因工程等手段对其进行功能研究，但目前发现的内切型褐藻胶裂解酶绝大多数作用温度范围较窄，对高温、酸碱和金属离子耐受性比较差，且降解产物为多种组分混合物从而干扰褐藻寡糖结构和功能的关联分析，在工业应用上受到很大的限制。

技术实现思路

[0006]本专利技术的主要目的是针对现有技术的不足，提供一种内切褐藻胶裂解酶(命名为VAL3)。
[0007]该酶的最适温度为35℃，最适pH为8.5，在0～65℃和pH 4.5～10.5范围内稳定性良好；Co
2+
、Cu
2+
、Mn
2+
和Fe
3+
能够明显促进该酶活性；该酶对海藻酸钠降解作用最强，也能降解多聚古洛糖醛酸和多聚甘露糖醛酸，降解这三种底物的主要产物为二糖。
[0008]编码该酶的核苷酸序列如下：(SEQ ID NO:1)
[0009][0010][0011]其中，5
’
端57bp片段为编码信号肽序列。该酶的氨基酸序列如下：(SEQ ID NO:2)
[0012][0013][0014][0015]其中，N端19个氨基酸为信号肽序列。
[0016]本专利技术的另一目的，在于提供一种内切褐藻胶裂解酶的制备方法，它包括如下步
骤：
[0017](1)基于弧菌(Vibrio sp.MCCC 1A13243)基因组测序数据分析获得内切褐藻胶裂解酶基因VAL3。
[0018](2)设计并合成扩增去除信号肽编码序列的内切褐藻胶裂解酶基因VAL3的引物，其序列如下：
[0019]上游引物VAL3F:5
’‑
GATCACATATGTGTACCTCTACTTCTGCT
‑3’
(SEQ ID NO:3)
[0020]下游引物VAL3R:5
’‑
GATCACTCGAGGCCTTCGTACTTGCTATG
‑3’
(SEQ ID NO:4)
[0021](3)PCR扩增及重组质粒的构建：
[0022]用VAL3F和VAL3R引物，以弧菌(Vibrio sp.MCCC 1A13243)的基因组DNA为模板进行扩增。PCR扩增条件如下：95℃预变性3min；95℃20s，52℃20s，72℃100s，30个循环；72℃延伸10min。PCR产物经限制性内切酶NdeI和XhoI酶切后被连接到经同样限制性内切酶酶切的表达载体pET
‑
22b上，将连接产物转化大肠杆菌Escherichia coli TOP10受体菌株，筛选含有内切褐藻胶裂解酶基因的重组质粒，并进行双酶切和测序验证。
[0023](4)内切褐藻胶裂解酶的表达与纯化
[0024]将含有内切褐藻胶裂解酶基因的重组质粒转化入大肠杆菌E.coli BL21受体菌株，用IPTG诱导内切褐藻胶裂解酶蛋白表达，采用Ni
‑
Sepharose亲和层析(Ni Sepharose
TM 6Fast Flow试剂盒)纯化蛋白。纯化后的内切褐藻胶裂解酶的SDS
‑
PAGE电泳检测结果如图1所示。
[0025]本专利技术的内切褐藻胶裂解酶属于PL7家族，具有宽泛的温度和pH作用范围，多种常见金属离子能促进该酶活性或对其活性影响不大，其降解产物主要为二糖组分，在生产单一褐藻寡糖方面具有优势。
附图说明
[0026]图1为纯化后的酶蛋白的SDS
‑
PAGE电泳；
[0027]图2为不同温度对酶活力的影响；
[0028]图3为酶在不同温度条件下的稳定性检测；
[0029]图4为不同pH对酶活力的影响；
[0030]图5为酶在不同pH条件下的稳定性检测；
[0031]图6为不同金属离子和酶抑制剂对酶活力的影响；
[0032]图7为酶对不同底物水解作用的效果；
[0033]图8为酶的降解产物分析
具体实施方式
[0034]实施例1内切褐藻胶裂解酶的制备
[0035]步骤如下：
[0036]实验材料
[0037]弧菌Vibrio sp.MCCC 1A13243(由中国海洋微生物菌种保藏管理中心保藏，保藏编号为1A13243，可通过购买方式得到)，大肠杆菌E.coli TOP10、大肠杆菌E.coil BL21(DE3)(购自ThermoFisher公司)、表达载体pET
‑
22b(购自ThermoFisher公司)；赛百盛细本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种表达内切褐藻胶裂解酶的基因序列，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。2.一种表达内切褐藻胶裂解酶的基因序列，其特征在于，其由权利要求1所述的基因序列去除其5
’
端57bp片段得到。3.一种重组载体，其含有权利要求1或2所述的一种表达内切褐藻胶裂解酶的基因序列。4.一种重组菌，其含有权利要求3所述的重组载体。5.重组菌突变体，其特征在于：其外源序列与权利要求1或2所述的基因序列的相似性大于98％。6.一种内切褐藻胶裂解酶，其特征在于：其蛋白序列如SEQ ID NO:2所示。7.一种内切褐藻胶裂解酶，其特征在于：其由权利要求6所述的内切褐藻胶裂解酶的蛋白序列去除其N端19个氨基酸得到。8.如权利要求6或7所述的内切褐藻胶裂解酶的用途，其用于褐藻利用和/或褐藻寡糖生产。9.一种内切褐藻胶裂解酶的制备方法，包括如下步骤：(1)获取弧菌Vibrio sp.MCCC 1A13243的基因组DNA作为模板，所述的模板含内切褐藻胶裂解酶基因VAL3；(2)设计并合成扩增去除信号肽编码序列的内切褐藻胶裂解...

【专利技术属性】
技术研发人员：邵宗泽，周梅先，陈琳，
申请(专利权)人：自然资源部第三海洋研究所，
类型：发明
国别省市：