一种人胚胎干细胞的构建方法技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，特别是涉及一种人胚胎干细胞的构建方法。本发明专利技术提供一种人胚胎干细胞的构建方法，所述构建方法包括：将人胚胎干细胞的基因组中整合外源的编码B2M-HLA-G1融合蛋白的多核苷酸，所述B2M-HLA-G1融合蛋白包括第一B2M片段和HLA-G1片段，整合获得的人胚胎干细胞不表达游离的B2M蛋白。本发明专利技术所提供的人胚胎干细胞的构建方法构建获得的人胚胎干细胞细胞系内源性HLA-A，B，C蛋白无法到达细胞膜表面，因此该细胞系不能被CD8

【技术实现步骤摘要】
一种人胚胎干细胞的构建方法


[0001]本专利技术涉及生物
，特别是涉及一种人胚胎干细胞的构建方法。

技术介绍

[0002]多能性干细胞具有能在体外培养环境中无限分裂增殖以及在特定诱导条件下定向分化为三胚层来源的所有细胞类型的能力，因此，在再生医学的未来发展中被给予了厚望。早在十年前，Thomson(Thomson et al.,1998)与Reubinoff(Reubinoff et al.,2000)教授等人便率先开始建立并分化人类胚胎干细胞系。在他们的研究基础上，更多的科学家开展了应用多能性干细胞作为功能性细胞来源，修复受损组织功能与治疗退行性疾病的研究。在动物模型当中，分化后的胚胎干细胞表现出了对脊髓损伤(Soundararajan et al.,2007)、糖尿病(Liu and Lee,2012)、帕金森氏病(Barberi et al.,2003)、肝衰竭(Soto-Gutierrez et al.,2006)等疾病的治疗能力。尽管有这些令人振奋的研究结果，与多能干细胞移植物相关的免疫排斥问题尚未有良好的解决方案，这已经成为了未来细胞替代疗法的最大临床应用障碍之一。

技术实现思路

[0003]鉴于以上所述现有技术的缺点，本专利技术的目的在于提供一种人胚胎干细胞的构建方法，用于解决现有技术中的问题。
[0004]为实现上述目的及其他相关目的，本专利技术一方面提供一种人胚胎干细胞的构建方法，所述构建方法包括：将人胚胎干细胞的基因组中整合外源的编码B2M-HLA-G1融合蛋白的多核苷酸，所述B2M-HLA-G1融合蛋白包括第一B2M片段和HLA-G1片段，整合获得的人胚胎干细胞不表达游离的B2M蛋白。
[0005]在本专利技术一些实施方式中，所述HLA-G1片段包括：
[0006]a)氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的多肽片段；或，
[0007]b)氨基酸序列与SEQ ID No.1具有90％以上序列一致性且具有a)限定的多肽片段的功能的多肽片段。
[0008]在本专利技术一些实施方式中，所述第一B2M片段包括：
[0009]c)氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的多肽片段；或，
[0010]d)氨基酸序列与SEQ ID No.2具有90％以上序列一致性且具有a)限定的多肽片段的功能的多肽片段。
[0011]在本专利技术一些实施方式中，所述B2M-HLA-G1融合蛋白还包括位于第一B2M片段和HLA-G1片段之间的第一柔性连接肽段；
[0012]和/或，所述B2M-HLA-G1融合蛋白自N端至C端依次包括第一B2M片段和HLA-G1片段，所述B2M-HLA-G1融合蛋白包括氨基酸序列如SEQ ID No.4所示的多肽片段。
[0013]在本专利技术一些实施方式中，将人胚胎干细胞的基因组中整合外源的编码B2M-HLA-G1融合蛋白的多核苷酸的方法具体包括：将HLA-G1片段的编码基因与人胚胎干细胞中内源
性的B2M基因融合，优选为将HLA-G1片段的编码基因替换位于内源B2M基因外显子3中的终止密码子。
[0014]在本专利技术一些实施方式中，所述构建方法还包括：将人胚胎干细胞的基因组中整合外源的编码B2M-HLA-G5融合蛋白的多核苷酸，所述B2M-HLA-G5融合蛋白包括第二B2M片段和HLA-G5片段。
[0015]在本专利技术一些实施方式中，所述第二B2M片段包括：
[0016]e)氨基酸序列如SEQ ID No.5所示的多肽片段；或，
[0017]f)氨基酸序列与SEQ ID No.5具有90％以上序列一致性且具有c)限定的多肽片段的功能的多肽片段。
[0018]在本专利技术一些实施方式中，所述HLA-G5片段包括：
[0019]g)氨基酸序列如SEQ ID No.6所示的多肽片段；或，
[0020]h)氨基酸序列与SEQ ID No.6具有90％以上序列一致性且具有e)限定的多肽片段的功能的多肽片段。
[0021]在本专利技术一些实施方式中，所述B2M-HLA-G5融合蛋白还包括位于第二B2M片段和HLA-G5片段之间的第二柔性连接肽段；
[0022]和/或，所述B2M-HLA-G5融合蛋白自N端至C端依次包括第二B2M片段和HLA-G5片段，所述B2M-HLA-G5融合蛋白包括氨基酸序列如SEQ ID No.8所示的多肽片段。
[0023]在本专利技术一些实施方式中，将人胚胎干细胞的基因组中整合外源的编码B2M-HLA-G5融合蛋白的多核苷酸的方法具体包括：通过慢病毒载体将编码B2M-HLA-G5融合蛋白的多核苷酸整合入人胚胎干细胞的基因组。
[0024]本专利技术另一方面提供一种人胚胎干细胞，由上述的人胚胎干细胞的构建方法构建获得。
附图说明
[0025]图1显示为本专利技术所构建的B2M
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，B2M
mHLAG
，B2M
m/sHLAG
hESCs细胞系及相关验证实验示意图。其中，(A)为逐步构建B2M
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，B2M
mHLAG
和B2M
m/sHLAG
细胞系系的基因编辑策略示意图；(B)为敲除B2M基因的双gRNA基因编辑策略示意图，切割位点由剪刀和箭头指出，PAM序列为紫色，用于基因组PCR的设计引物的位置显示为三角形；(C)为双gRNA基因编辑方案敲除B2M实验中所获得的7个抗药型细胞克隆的基因组PCR结果示意图，其中，双等位基因缺失的克隆标记为红色，使用的引物在(B)中指出；(D)为在B2M基因座中敲入HLA-G1的基因编辑策略示意图，用于基因组PCR的引物显示为三角形，设计用于Southern Blot的探针显示为黑线；(E)为HLA-G1敲入实验中获得的5个细胞克隆的基因组DNAPCR结果示意图，纯合子敲入细胞系标记为红色，所用的引物在(D)中指示；(F)为Southern Blot结果示意图，证明了在(E)中所示的细胞克隆4中，HLA-G1被精确的整合进了B2M基因中，且在基因组其他位点未发现整合，所使用的探针在(D)中标出。
[0026]图2显示为本专利技术所构建的B2M
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与B2M
mHLAG
细胞系脱靶现象验证结果示意图。其中，(A)为B2M
null
hESCs结果示意图，其中，靶向B2M的gRNA1和gRNA2各自的5个预测脱靶位点均未发现DNA突变；(B)为B2M
mHLAG
hESCs结果示意图，其中，靶向B2M的gRNA3的所有5个预测脱靶位点均未发现DNA突变。
[0027]图3显示为本专利技术WT，B2Mnull，B2MmHLAG与B2Mm/sHLAG细胞系中B2M与HLA I蛋白质表达情况示意图。其中，(A)为在加入(橙色)或不加(浅蓝色)IFN-γ刺激的情况下，使用流式细胞术检测B2M，HLA-G，HLA-A*03(存在于WT H9细本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种人胚胎干细胞的构建方法，所述构建方法包括：将人胚胎干细胞的基因组中整合外源的编码B2M-HLA-G1融合蛋白的多核苷酸，所述B2M-HLA-G1融合蛋白包括第一B2M片段和HLA-G1片段，整合获得的人胚胎干细胞不表达游离的B2M蛋白。2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述HLA-G1片段包括：a)氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的多肽片段；或，b)氨基酸序列与SEQ ID No.1具有90％以上序列一致性且具有a)限定的多肽片段的功能的多肽片段。3.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述第一B2M片段包括：c)氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的多肽片段；或，d)氨基酸序列与SEQ ID No.2具有90％以上序列一致性且具有a)限定的多肽片段的功能的多肽片段。4.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述B2M-HLA-G1融合蛋白还包括位于第一B2M片段和HLA-G1片段之间的第一柔性连接肽段；和/或，所述B2M-HLA-G1融合蛋白自N端至C端依次包括第一B2M片段和HLA-G1片段，所述B2M-HLA-G1融合蛋白包括氨基酸序列如SEQ ID No.4所示的多肽片段。5.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，将人胚胎干细胞的基因组中整合外源的编码B2M-HLA-G1融合蛋白的多核苷酸的方法具体包括：将HLA-G1片段的编码基因与人胚胎干细胞中内源性的B2M基因融合，优选为将HLA-G1片段的编码基因替换位于内源B2M基因外显子3中的...

【专利技术属性】
技术研发人员：章小清，刘玲，
申请(专利权)人：同济大学，
类型：发明
国别省市：