一种采用尿囊素降低明胶中内毒素的方法技术

本发明专利技术公开了一种采用尿囊素降低明胶中内毒素的方法，包括以下步骤：在容器中，将待处理明胶溶于温度保持在45-55℃的水中，调节明胶溶液pH为4.5-6.0；加入氯化钠，在45-55℃下搅拌10-30min；加入尿囊素，得预处理溶液；在45-55℃下搅拌孵育15-60min，过滤，浓缩，灭菌，干燥，粉碎，得低内毒素明胶颗粒。经该方法处理的明胶中内毒素含量低于200EU/g，且处理过程对明胶性质无显著影响，冻力，粘度，粘降，凝冻点和灰分指标在处理前后改变程度在5％以内，可广泛应用在制备可吸收止血海绵、可再生医药、医用辅食等领域；且该方法工艺过程简单温和，能够实现准工业化水平的放量制备。能够实现准工业化水平的放量制备。

【技术实现步骤摘要】
一种采用尿囊素降低明胶中内毒素的方法


[0001]本专利技术涉及医药用明胶
更具体地，涉及一种采用尿囊素降低明胶中内毒素的方法。

技术介绍

[0002]明胶是一种由动物的皮和骨中的胶原，经过酸、碱和酶部分水解并经纯化后得到的产物。明胶的传统应用非常广泛，按照应用领域可分为食品添加剂明胶、药用明胶和工业明胶。中国药典2015版明确规定了药用明胶，胶囊用明胶的指标要求，但对于明胶中内毒素中的含量没有规定。
[0003]作为一种良好的蛋白源，明胶生产过程中的胶液浓度，温度和pH十分适宜革兰氏阴性菌的生长与繁殖。细菌内毒素(BET)的化学结构为脂多糖(LPS)，位于革兰氏阴性菌的外膜，它不断被细菌释放到环境中。当革兰氏阴性细菌死亡并溶解时，所有的脂多糖被释放到环境中。当细菌内毒素被注射到哺乳动物(包括人类)体内时，达到一定的阈值，会激活人体防御系统，产生体温升高、呕吐不适、皮肤血管收缩、血压升高、肌肉酸痛，严重者会导致休克和死亡。
[0004]随着明胶在医学领域的广泛应用，明胶代血浆、明胶止血海绵、明胶缝合线、明胶支架等直接进入血液循环的明胶产品不断投入应用。但文献中少见低内毒素明胶的生产工艺报导。骨明胶生产所用的原料骨中包含一定量的细菌，在生产过程中，高温、化学试剂及灭菌等方法导致细菌死亡，并产生大量内毒素。常规的明胶生产工艺没有内毒素的控制与消除工序。绝大多数明胶的内毒素在1000EU/g以上，部分明胶超过 10000Eu/g。细菌内毒素通过口服的形式进入人体时，经过胃肠的消化，对健康人体不会产生毒性。因此当明胶以胶囊或片剂辅料的形式口服经胃肠给药时不必考虑内毒素水平。但当明胶作为注射剂或者与血液、髓鞘直接接触时，内毒素是最为重要的质控指标，必须根据各国药典等相关文件规定低于相应的阈值。内毒素影响细胞在组织工程支架表面的粘附、生长与分化，因此，严格控制植入性医疗器械内毒素指标是确保器械安全的关键。
[0005]明胶属于大分子蛋白质。通常，对于蛋白质中内毒素的去除方法主要包括非特异性去除法与选择性分离法。非特异性去除法包括干热法，化学法，活性炭吸附法，超滤法和离子交换法，由于明胶在高温、酸性和碱性条件下会发生变性，导致明胶发生交联或者降解，因此干热法和化学法不适用。明胶分子量分布区间与内毒素几乎重叠，因此无法通过超滤法从明胶中分离出内毒素。明胶中包含大量的阴离子基团，如果采用离子交换法，相当一部分明胶会被树脂吸附导致明胶回收率大大降低。选择性去除方法主要指的是亲和色谱法，利用的是物质的生物学特性来达到物质分离的目的，是一种理论上较为理想的内毒素去除方法，该方法的难点在于开发合适的配基，并将其固载与亲和色谱基质上以合成出亲和介质，目前尚不具备规模化制备的能力。有文献利用Triton-X114分离琥珀酰明胶中内毒素，但残留的Triton-X114具有毒性，很难将其完全去除。
[0006]因此需要提供一种能够有效降低明胶中内毒素的方法，以扩大明胶的应用范围。

技术实现思路

[0007]本专利技术的一个目的在于提供一种采用尿囊素降低明胶中内毒素的方法，该方法以尿囊素作为内毒素吸附剂，可使明胶中内毒素含量降至200EU/g以下，且该方法可规模化应用。
[0008]本专利技术的另一个目的在于提供一种低内毒素明胶在制备可吸收止血海绵、可再生医药、医用辅食等中的应用。
[0009]为达到上述目的，本专利技术采用下述技术方案：
[0010]第一方面，本专利技术提供一种采用尿囊素降低明胶中内毒素的方法，包括以下步骤：
[0011]在容器中，将待处理明胶溶于温度保持在45-55℃的水中，调节明胶溶液pH为 4.5-6.0；加入氯化钠，在45-55℃下搅拌10-30min；加入尿囊素，得预处理溶液；在45-55℃下搅拌孵育15-60min，过滤，浓缩，灭菌，干燥，粉碎，得低内毒素明胶颗粒。
[0012]明胶属于蛋白质，在高温、强酸碱条件下会发生变性或者水解；明胶中包含大量的—COOH、—OH、—NH2等基团，十分容易与内毒素以氢键的方式结合。但与普通的蛋白质相比，明胶具有独特的溶胶凝胶转化性质，通常浓度为10％明胶溶胶的凝胶点在25-30℃之间，对于高冻力明胶，重量浓度为0.5％以上时在室温下主要以凝冻状态存在；明胶的分子量在5KDa到几千KDa之间，几乎覆盖了内毒素的分子量分布区间，因此从明胶中分离内毒素是十分困难的。
[0013]待处理明胶中的内毒素含量通常在1000EU/g以上，甚至能够超过10000Eu/g，无法与血液、髓鞘直接接触，限制了明胶的应用。本专利技术提供了降低明胶中内毒素的方法，即采用尿囊素作为内毒素的吸附剂。尿毒素(2,5-二氧基-4-咪唑烷基脲)可通过氢键和电荷作用吸附内毒素，且吸附效果优良，同时尿毒素无毒，具有促进细胞生长、促进伤口愈合等生理功能，常作为生物材料添加剂使用。
[0014]需要说明的是，由于内毒素的分子量及活性随介质变化而变化，因此本专利技术中，明胶中内毒素浓度被定义为每克明胶中内毒素单位(EU)。内毒素浓度的测定是以大肠杆菌0113：H10K作为参比，通过鲎试剂显色法测试明胶中内毒素含量。
[0015]可选地，所述待处理明胶为酸法明胶或碱法明胶；当所述待处理明胶为酸法明胶时，调节明胶溶液pH为5.5-6.0；当所述待处理明胶为碱法明胶时，调节明胶溶液 pH为4.5-4.6。
[0016]本专利技术提供的采用尿囊素降低明胶中内毒素的方法，通过调节不同类型明胶溶液的pH，以及加入氯化钠的量和方式，增强内毒素与尿囊素的相互作用，提高分离效率。本专利技术结合明胶的溶胶凝胶转化特性及热降解特性，将温度控制在45～55℃，即能够使胶液处于液体状态，又能够避免高温下明胶的进一步水解；尿囊素的溶解度为 0.5g/L，过量的尿囊素将以晶体状态存在于明胶溶液中，通过氢键和静电相互作用吸附带负电荷的内毒素。明胶的等电点是影响吸附效率和明胶得率的重要因素，为了防止明胶与尿囊素的异向电荷吸引，需要根据等电点的差异调节明胶溶液的pH，使明胶分子带正电荷，由于酸法明胶的等电点为6～9，因此pH调节在5.5-6.0之间。碱法明胶的等电点为4.8-5.0，调节碱法明胶溶液的等电点为4.5-4.6之间。加入氯化钠主要是通过减少明胶的极性，减小对内毒素的吸附时明胶与尿囊素的竞争。可选地，所述明胶溶液的浓度为2-10wt％。适宜的明胶溶液浓度有利于提高分离效率，并减少膜过滤补充用水的内毒素残留。明胶浓度过低时，明胶溶液中的尿
囊素溶解量增大，不但使尿囊素用量增加，而且增大了后处理膜过滤时去除尿囊素的负担；明胶浓度过高时，溶液粘度增加，增大了尿囊素与内毒素的结合难度。
[0017]可选地，所述待处理明胶的内毒素含量为200-20000EU/g。各国药品监察机构对与血液接触的生物制品中的BET含量有十分严格的规定。中国药典2015版、美国药典USP<85>和欧洲药典Ph.Eur.2.6.14规定，非经肠道给药制剂的内毒素含量必须少于5EU/Kg/本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种采用尿囊素降低明胶中内毒素的方法，其特征在于，包括以下步骤：在容器中，将待处理明胶溶于温度保持在45-55℃的水中，调节明胶溶液pH为4.5-6.0；加入氯化钠，在45-55℃下搅拌10-30min；加入尿囊素，得预处理溶液；在45-55℃下搅拌孵育15-60min，过滤，浓缩，灭菌，干燥，粉碎，得低内毒素明胶颗粒。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待处理明胶为酸法明胶或碱法明胶；当所述待处理明胶为酸法明胶时，调节明胶溶液pH为5.5-6.0；当所述待处理明胶为碱法明胶时，调节明胶溶液pH为4.5-4.6。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述明胶溶液的浓度为2-10wt％；优选地，所述待处理明胶的内毒素含量为200-20000EU/g。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述预处理溶液中氯化钠的浓度为5-50mmol/L；优选地，所述预...

【专利技术属性】
技术研发人员：张兵，郭燕川，张炜杰，王颖，刘芳，王富荣，贾利明，
申请(专利权)人：包头东宝生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：