玉米干旱诱导表达基因ZmRD101启动子及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种玉米干旱诱导表达基因ZmRD101启动子及其应用，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。本发明专利技术基因ZmRD101启动子具有干旱下诱导高表达，正常生长低表达的特性，可用于转基因育种领域。通过构建含有该启动子的植物表达载体，转化到植物，例如单子叶植物玉米的基因组中，驱动目的基因在干旱下特异性高表达，在正常状态下低表达。可用来平衡产量和抗逆的矛盾，用于培育新的育种材料，为进一步的玉米抗逆育种提供基础。玉米抗逆育种提供基础。玉米抗逆育种提供基础。

【技术实现步骤摘要】
玉米干旱诱导表达基因ZmRD101启动子及其应用


[0001]本专利技术涉及植物基因工程
，具体地指一种玉米干旱诱导表达基因ZmRD101启动子及其应用。

技术介绍

[0002]玉米是重要的粮食作物，也是重要的饲料和工业原料。玉米的生产受到干旱的严重威胁。有数据表明，吐丝期的干旱能造成玉米约50％的减产。鉴定抗旱基因，培育抗旱品种是解除干旱威胁的根本途径。近年来的研究也已鉴定和克隆出了一系列玉米抗旱基因，但这些基因在抗旱育种中的应用仍非常有限。抗旱与产量在一定程度上存在拮抗关系，简单聚合抗逆基因可能会造成玉米在正常年份的减产，这在生产上并不能被接受。
[0003]现代基因工程的发展为玉米抗旱育种提供了新的方向。供体、受体和载体是基因工程的三大要素。启动子作为调控基因表达的工具，是基因工程中表达载体的重要组成元件。启动子可按照作用方式分为三类：组成型启动子、组织特异启动子和诱导型启动子。而诱导型启动子和组织特异启动子往往具有相似的特征。在抗逆育种中，诱导型启动子往往比组成型启动子具有更广泛的用途。组成型启动子驱动的基因往往在任何组织任何时间都会大量表达，从而使植物始终处于一种逆境应答状态，进而影响无逆境条件下的植物生长。
[0004]目前在玉米转基因技术中使用的启动子多为组成型启动子 Ubi，目的基因会在植物整个生命周期和所以组织部位以较高水平表达，这样将导致植物能量的过度浪费和基因产物的过度积累以及代谢过程的紊乱，因此转基因植物抗逆性的提升往往以产量大幅下降甚至是植株死亡作为代价。
专利
技术实现思路

[0005]本专利技术目的是提供了一种玉米干旱诱导表达表达基因 ZmRD101启动子及其应用，本专利技术为玉米抗旱育种提供基础，本专利技术选择合理的诱导型启动子可以使目的基因只在逆境下表达。对诱导型启动子的研究有助于对玉米抗逆基因进行更加精准的调控，实现抗逆与产量的平衡，从而为玉米抗逆育种提供方向。
[0006]为实现上述目的，本专利技术提供的一种玉米干旱诱导表达基因 ZmRD101启动子，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。其来源于玉米B73自交系。
[0007]本专利技术提供了用于获得上述玉米干旱诱导表达基因ZmRD101 启动子的引物对，所述引物对为：
[0008]正向引物P1：5
’‑
TTCACTTTTTTAGTCTGGCAAT
‑3’
[0009]反向引物P2：5
’‑
GCTCACGGTTGCCTTG
‑3’
[0010]本专利技术提供了一种玉米干旱诱导表达基因ZmRD101启动子的获得方法，以具有玉米干旱特异表达基因ZmRD101的玉米基因组 DNA为模板，采用以下引物对：
[0011]正向引物P1：5
’‑
TTCACTTTTTTAGTCTGGCAAT
‑3’
[0012]反向引物P2：5
’‑
GCTCACGGTTGCCTTG
‑3’
[0013]进行PCR扩增，其所获得的玉米干旱诱导表达基因ZmRD101 启动子序列为SEQ IDNO.1所示。
[0014]作为优选方案，所述PCR反应体系：
[0015]2x phanta Buffer10uldNTP0.4ul正向引物P10.8ul反向引物P20.8ulPhanta max0.4ulcDNA1.5ulddH2O6.9ul
[0016]所述PCR反应条件：95℃预变性3min；95℃变性30sec；60℃退火30sec；72℃延伸75sec；循环35次后；72℃延伸5min。
[0017]本专利技术还提供了一种重组表达载体，它为含有上述玉米干旱诱导表达基因ZmRD101启动子的植物表达载体。
[0018]作为优选方案，所述植物表达载体为pZZ01523。含有本专利技术启动子的重组载体、含有载体的宿主菌株、表达盒、转基因细胞系或转基因植株均属于本专利技术的保护范围。
[0019]本专利技术提供了一种上述重组表达载体的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：
[0020]1)以玉米B73自交系干旱诱导表达基因ZmRD101启动子序列如SEQ IDNO.1所示为模板设计引物对，如下：
[0021]RD101
‑
F： 5
’‑
CCTGTCAAACACTGATAGTTTTTCACTTTTTTAGTCTGGCAAT
‑3’
，
[0022]RD101
‑
R： 5
’‑
CCGGGATACTAGTGCGTTTAAACGCTCACGGTTGCCTTG
‑3’
(下划线为 PMEI酶切位点)；
[0023]2)以玉米干旱诱导表达基因ZmRD101序列为模板进行PCR，基因PCR产物，PCR扩增条件如下：
[0024]反应体系：
[0025]2x phanta Buffer10uldNTP0.4ul正向引物P10.8ul反向引物P20.8ulPhanta max0.4ulcDNA1.5ulddH2O6.9ul
[0026]所述PCR反应条件：95℃预变性3min；95℃变性30sec；60℃退火30sec；72℃延伸75sec；循环35次后；72℃延伸5min；
[0027]3)线性化载体制备：使用限制性内切酶PMEI单酶切pZZ01523 载体，使环状载体线性化；
[0028]4)重组产物制备：
[0029]a.将酶切的基因PCR产物与载体酶切产物的检测与回收：琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物与载体酶切产物。使用Omega Bio
‑
tek GelExtraction Kit回收目的片段。
[0030]b.胶回收产物重组：使用Vazyme ClonExpress II One Step Cloning Kit进行同源重组；反应体系如下：
[0031]线性化载体200ng插入片段120ng5x CE II buffer4ulExnase II2ulddH2O to20ul
[0032]使用移液器轻轻吸打混匀，经短暂离心后将反应液收集至离心管管底；37℃水浴30min，放置冰上静置至室温。
[0033]5)验证
[0034]a.重组产物转化：重组产物转化DH5α感受态细胞，参照分子克隆实验指南；
[0035]b.重组产物菌落PCR；
[0036]c.重组质粒提取：参照分子克隆实验指南
[0037]本专利技术提供了一种下述各项之一在启动目的基因表达和培育植物新品种中的应用，
[0038]1)上述的启动子；
[0039]2)上述的重组表达载体；
[0040]本专利技术的有益效果在于：
[0041]本专利技术基因ZmRD101启动子具有干旱下诱导高表达，正常生长低表达的特性，可用于转基因育种领域。通过构建含有该启动子的植物表达载体，转化到植本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种玉米干旱诱导表达基因ZmRD101启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.一种用于获得权利要求1所述玉米干旱诱导表达基因ZmRD101启动子的引物对，其特征在于：所述引物对为：正向引物P1：5
’‑
TTCACTTTTTTAGTCTGGCAAT
‑3’
；反向引物P2：5
’‑
GCTCACGGTTGCCTTG
‑3’
。3.一种权利要求1所述玉米干旱诱导表达基因ZmRD101启动子的获得方法，其特征在于：以具有玉米干旱特异表达基因ZmRD101的玉米基因组DNA为模板，采用以下引物对：正向引物P1：5
’‑
TTCACTTTTTTAGTCTGGCAAT
‑3’
；反向引物P2：5
’‑
GCTCACGGTTGCCTTG
‑3’
；进行PCR扩增，其所获得的玉米干旱诱导表达基因ZmRD101启动子序列为SEQ ID NO.1所示。4.根据权利要求3所述的获得方法，其特征在于：所述PCR扩增的反应体系：所述PCR反应条件：95℃预变性3min；95℃变性30sec；60℃退火30sec；72℃延伸75sec；循环35次后；72℃延伸5min。5.一种重组表达载体，其特征在于：它为含有上述玉米干旱诱导表达基因ZmRD101启动子的植物表...

【专利技术属性】
技术研发人员：代明球，何能，向艳丽，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：