一种三七诱导型启动子PPL1及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种三七诱导型启动子PPL1及其应用，PPL1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，本发明专利技术通过分子生物学和基因工程相关技术研究证实三七启动子PPL1对几种植物激素、生物胁迫和非生物胁迫的响应，将本发明专利技术三七诱导型启动子PPL1与β

【技术实现步骤摘要】
一种三七诱导型启动子PPL1及其应用


[0001]本专利技术涉及分子生物学以及基因工程相关研究领域，具体涉及一种三七诱导型启动子PPL1及其应用。

技术介绍

[0002]启动子位于结构基因5端上游区域，是DNA序列的一部分，用控制基因表达。启动子在真核生物和原核生物中均存在，且具有调控功能的蛋白基因的启动子大都是由转录起始位点、核心元件序列、顺式作用元件等组分构成。核心元件就是TATA
‑
box，一般位于
‑
25bp~
‑
30bp，被认为是RNA聚合酶的结合位点。除此之外，重要的上游启动子元件也包括CAAT
‑
box、GC
‑
box等，它们一般是和基因特异性转录因子相结合，并与核心元件TATA
‑
box协同发挥作用。
[0003]启动子具有方向性、结构特异性、位置特异性和种属特异性等特点。启动子按功能及作用方式可分为组成型启动子、诱导型启动子和组织特异性启动子。组成型启动子其特点是不受时空限制，在植物的整个生命过程和组织中都持续表达。也不受环境胁迫诱导，其RNA和产物表达量也基本恒定。目前，许多组成型启动子被发现并应用于植物基因工程中。最常见、应用也最广泛的是花椰菜花叶病毒（CaMV 35S）启动子、胭脂碱合成基因（NOS）启动子、水稻肌动蛋白启动子（Act1）等；组织特异型启动子则除了具有组成型启动子的结构特性外，通常也包含增强子和沉默子结构；能够调控基因在特定组织和器官中表达是该类型启动子的特点之一；目前，人们已经研究发现了许多组织特异性的启动子，如根特异性启动子、种子特异性启动子等。
[0004]诱导型启动子的特点是可以使基因的表达受外源物理、化学因素的诱导。当没有诱导物存在时该启动子表达水平很低甚至没有，当受到诱导时则大量表达以应对不利环境。由于植物无法靠自身移动来躲避环境中的不利因素，所以植物需要通过一些方式来加强防御机制，应对危害。当植物受到环境中某些信号，如病毒、细菌等生物入侵机体，干旱、水淹、低温、高温等非生物胁迫，还有动物的啃食等机械性的损伤等诸如此类的胁迫影响时，植物机体会产生一定的应答反应。在这类应答机制中，诱导型启动子发挥着不可或缺的重要作用。同时特异性的启动子还可避免基因过量表达对植物体产生伤害，所以加深和加大对诱导型启动子的探究和应用成为人们追求的目标。
[0005]诱导型启动子通常以诱导信号命名，如光诱导型启动子、热诱导型启动子、创伤诱导型启动子、激素诱导型启动子和真菌诱导型启动子。利用染色体步移技术，从百合(Lilium regale)的PR10
‑
5基因末端扩增出1489 bp的启动子，并与GUS报告基因连接转入烟草(Nicotiana tabacum)中，结果表明百合PR10
‑
5启动子是一个多重应激诱导型启动子。赤霉素，脱落酸和乙烯对PR10
‑
5启动子均有正调控的功能，其中赤霉素对启动子的诱导作用最强；盐胁迫和伤胁迫等非生物胁迫处理后，转基因烟草的GUS活性明显增强，表明盐胁迫和伤胁迫也正调控PR10
‑
5启动子；尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）和灰葡萄孢（Botrytis cinerea）处理对PR10
‑
5启动子GUS活
性的诱导也十分显著（Chen R, He H, Yang Y, Qu Y, Ge F, Liu DQ. Functional characterization of a pathogenesis
‑
related protein family 10 gene, LrPR10
‑
5, from Lilium regale Wilson. Australas Plant Path, 2017, 46(3):1
‑
9）。Lin等将荠菜（Capsella bursa
‑
pastoris）中的CbICE53构成重组载体，转化烟草之后发现，过表达载体中CbICE53在胁迫诱导型启动子CbCOR15b驱动下比在组成型启动子CbCBF驱动下显示出更高的低温耐受性（Lin P, Shen C, Chen H, Yao XH, Lin J. Improving tobacco freezing tolerance by co
‑
transfer of stress
‑
inducible CbCBF and CbICE53 genes. Biol Plant, 2017, 61:520
‑
528.）。目前人们得到的各类启动子中，由于诱导型启动子较组成型启动子而言，其具有在特异环境条件下表达的独特优势，因此在利用基因工程手段提高植物耐逆性中具有很大的应用前景。

技术实现思路

[0006]本专利技术目的是提供一种诱导型启动子PPL1，来源于三七，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0007]本专利技术另一目的是将该启动子应用在基因工程中，即在生物、非生物胁迫下作为诱导表达启动子调控外源基因在转基因受体植物中的特异高效表达。
[0008]本专利技术涉及分离诱导型启动子片段并鉴定其表达活性，本专利技术从三七中克隆获得诱导型启动子，该启动子长547bp；生物信息学分析表明该诱导型启动子中包含一系列不同的顺式作用元件。
[0009]将本专利技术分离克隆的诱导型启动子片段置换pBI121载体上的CaMV的35s启动子，由诱导型启动子驱动报告基因GUS的表达框，通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导将其转入模式植物烟草(Nicotiana tabacum)中表达，并通过进一步实验揭示诱导型启动子的表达特性，为后期利用该启动子调控外源基因在转基因植株中的高效特异表达奠定基础，专利技术人将这个启动子命名为PPL1。
[0010]将本专利技术中PPL1启动子驱动GUS的表达框转入烟草中，采用植物激素、生物胁迫和非生物胁迫处理转基因烟草植株，并进行GUS活性的荧光定量分析，检测结果表明，PPL1启动子响应几种植物激素、生物胁迫和非生物胁迫的处理，乙烯利、水杨酸、赤霉素、氯化铝、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、茄腐镰刀菌(Fusarium solani)能明显诱导启动子PPL1的活性。
[0011]上述启动子PPL1可以在基因工程中应用于外源基因的诱导表达，具体操作如下：（1）从三七幼嫩组织中提取基因组DNA，采用扩增PPL1的特异引物，通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增出PPL1序列，然后将其连接到pGEM
‑
T载体上，经测序获得具有序列正确的克隆；（2）用限制性内切酶酶切pGEM
‑
T
‑
PPL1载体，回收启动子片段本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种诱导型启动子PPL1，来源于三七，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。2.权利要求1所述的诱导型启动子PPL1在植物抗...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘迪秋，郑锂蕾，梁婷婷，邓婕，苏琳琳，曲媛，葛锋，崔秀明，
申请(专利权)人：昆明理工大学，
类型：发明
国别省市：